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SSB/La蛋白在HEK293F细胞中的高效表达、纯化及初步应用
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作者 周清华 刘嘉玥 +3 位作者 邵亚丹 徐延伟 赵巧辉 李桂林 《检验医学与临床》 CAS 2024年第S01期115-119,共5页
目的天然SSB/La抗原存在难获取、成本高等问题,故使用HEK293F细胞尝试表达重组SSB/La蛋白。方法调取人SSB/La序列并进行基因密码子优化和合成,亚克隆至哺乳动物重组表达质粒后转染HEK293F细胞,完成培养后组合使用DEAE离子交换层析和Ni... 目的天然SSB/La抗原存在难获取、成本高等问题,故使用HEK293F细胞尝试表达重组SSB/La蛋白。方法调取人SSB/La序列并进行基因密码子优化和合成,亚克隆至哺乳动物重组表达质粒后转染HEK293F细胞,完成培养后组合使用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析纯化目的蛋白。结果重组SSB/La蛋白在HEK293F细胞中成功表达,随后纯化获得了高纯度的重组SSB/La蛋白,且进一步通过抗SSB抗体检测试剂盒初步证实了重组SSB/La蛋白具有优良的性能。结论成功实现了SSB/La蛋白制备,为其工业化生产及商业化应用奠定坚实的理论基础。 展开更多
关键词 ssb/La HEK293F 蛋白表达 纯化 初步应用
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干燥综合征患者血清抗α-胞衬蛋白、抗SSA/SSB抗体、IFN-γ及TNF-α与唇腺病理损害相关性研究 被引量:22
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作者 赵小莹 白宁 +4 位作者 陈群 邱红霞 王喆 刘芯如 惠保卫 《陕西医学杂志》 CAS 2020年第2期241-246,共6页
目的:观察干燥综合征患者(SS)血清抗α-胞衬蛋白、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及抗SSA/SSB抗体与患者唇腺活检病理损害的关系,探讨SS患者的抗体表达、免疫异常与唇腺病理损害的相关性。方法:收集SS患者36例为SS组... 目的:观察干燥综合征患者(SS)血清抗α-胞衬蛋白、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及抗SSA/SSB抗体与患者唇腺活检病理损害的关系,探讨SS患者的抗体表达、免疫异常与唇腺病理损害的相关性。方法:收集SS患者36例为SS组。具有口干症状、慢性非唇腺、唾液腺免疫性炎症的非干燥综合征患者24例为非SS组,两组均行唇腺活检。同时记录患者的一般资料及临床数据,包括年龄、性别、病程、临床体征,记录口干评分,血清学指标包括类风湿因子(RF)、C-反应蛋白(CRP)、血细胞沉降率(ESR),抗SSA/SSB抗体、血清干扰素水平等。结果:①与非SS组比较,SS组唇腺活检阳性率达100%,显著高于非SS组(P<0.05);两组的年龄和性别比较差异无统计学意义(均P>0.05)。②与非SS组比较,SS组的CRP及ESR水平明显增高(P<0.05),抗α-胞衬蛋白、抗SSA/SSB抗体、抗CCP抗体、RF阳性率也高于非SS组。③与轻度病理损伤组比较,中重度病理损伤组抗α-胞衬蛋白的比率无统计学差异;与轻度病理损伤组比较,中重度病理损伤组抗SSB抗体阳性率均明显升高,两组比较差异具有统计学意义,而抗SSA抗体两组间比较无统计学差异(P>0.05)。③TNF-α与每低倍视野下导管扩张数、腺泡萎缩数具有相关性(P<0.05),而CRP、ESR与其未见相关性(P>0.05);TNF-α、CRP和ESR与唇腺灶性指数、淋巴细胞计数均具有相关性(P<0.05);IFN-γ与淋巴细胞计数具有相关性(P<0.05),而与导管扩张数、腺泡萎缩数未见明显相关性(P<0.05)。结论:SS的发病与免疫异常密切相关,SS的唇腺淋巴细胞浸润、腺泡损害等病理损害,可能由于多种自身抗体、细胞因子的作用调控而发生发展的。 展开更多
关键词 原发性干燥综合征 Α-胞衬蛋白 抗SSA/ssb抗体 干扰素-Γ 唇腺 病理
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流产布鲁菌免疫原性蛋白SSB的鉴定及其反应原性分析 被引量:2
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作者 宋美莹 田明星 +7 位作者 连拯民 尹伊 李子晨 胡海 管祥 丁铲 蔡玉梅 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第3期79-87,共9页
本研究通过免疫印迹试验分析流产布鲁菌感染小鼠不同阶段的血清中以及临床牛羊布病阳性血清中抗体生成规律和特点,确定布鲁菌主要免疫原性蛋白的相对区域。结果显示:布鲁菌感染小鼠2周后抗体逐渐产生,在6~8周达到顶峰,之后维持稳定状态... 本研究通过免疫印迹试验分析流产布鲁菌感染小鼠不同阶段的血清中以及临床牛羊布病阳性血清中抗体生成规律和特点,确定布鲁菌主要免疫原性蛋白的相对区域。结果显示:布鲁菌感染小鼠2周后抗体逐渐产生,在6~8周达到顶峰,之后维持稳定状态;结合临床牛羊血清分析发现布鲁菌免疫原性蛋白主要集中在相对分子量40~70 kDa和7~20 kDa的两个区域;通过SDS-PAGE分离布鲁菌总蛋白,对照免疫印迹试验结果,切取免疫原性蛋白条带进行质谱分析,共鉴定到10个布鲁菌免疫原性蛋白;在大肠杆菌中成功表达和纯化了免疫原性蛋白SSB;免疫印迹试验显示,纯化的SSB蛋白可与临床牛布病阳性血清产生较好的反应,但检测阳性样本时也会产生阴性反应,检测效率与虎红平板凝集试验相比略差,在检测阳性样本时,与虎红平板凝集试验的符合率约为82%。该研究为布病诊断试剂研发奠定基础。 展开更多
关键词 流产布鲁菌 免疫原性蛋白 ssb蛋白 反应原性
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动力学毛细管电泳法求解蛋白质与单链脱氧核糖核苷酸结合的解离常数及可靠性分析 被引量:2
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作者 魏强 杨歌 +1 位作者 管桦 屈锋 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期332-338,共7页
平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)可用于测定复合物的解离常数(K_d)。该文以单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白(SSB)和单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)相互作用为模型,分析了相互作用强弱的电泳图谱特征,测定了不同条件下复合物的K_d,建立了... 平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)可用于测定复合物的解离常数(K_d)。该文以单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白(SSB)和单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)相互作用为模型,分析了相互作用强弱的电泳图谱特征,测定了不同条件下复合物的K_d,建立了基于积分偏差的误差分析方法。结果表明,SSB与ssDNA相互作用强弱所致的电泳图差异、SSB与ssDNA的浓度比、毛细管分离温度均影响K_d的计算。此外,基于25℃时SSB与5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer)人凝血酶适配体作用模型的数值分析结果表明,在现有实验条件下,手动积分峰面积时产生的面积偏差对K_d计算结果有影响,但在10%的偏差区间内,所求K_d值的最大相对偏差小于7%,所求K_d值的误差可忽略。该文证实了基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠。 展开更多
关键词 动力学毛细管电泳 单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白 解离常数 积分偏差
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小菜粉蝶颗粒体病毒lef-3基因的克隆与分析 被引量:1
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作者 孟祥坤 贡成良 +2 位作者 薛仁宇 曹广力 朱越雄 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期4411-4419,共9页
【目的】研究杆状病毒lef-3基因的起源与进化,从分子水平明确病毒之间的亲缘关系。【方法】通过常规PCR方法获得小菜粉蝶颗粒体病毒晚期基因表达调控因子lef-3的基因片段,克隆后测序,然后利用软件对lef-3及编码序列进行生物信息学分析... 【目的】研究杆状病毒lef-3基因的起源与进化,从分子水平明确病毒之间的亲缘关系。【方法】通过常规PCR方法获得小菜粉蝶颗粒体病毒晚期基因表达调控因子lef-3的基因片段,克隆后测序,然后利用软件对lef-3及编码序列进行生物信息学分析。【结果】克隆得到的PiraGVlef-3基因ORF序列中存在4个突变位点,但氨基酸性质未发生改变,推导PiraGV LEF-3蛋白含399个氨基酸残基,分子量为3.99kD;通过高级结构预测及其编码序列与其它杆状病毒的LEF-3同源性比对表明,该基因可能编码单链DNA结合蛋白;BLAST比对发现lef-3基因只存在于鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒基因组;进化分析表明LEF-3可分为3组,其中GV属的LEF-3聚类为1个组,NPV属的LEF-3聚类为2个组;GV的lef-3基因编码区的选择压力分析表明,大多数lef-3基因间相比较表现为负向选择,但不同lef-3基因间的Ka/Ks不同,也有正向选择;起源分析表明,杆状病毒lef-3基因可能来源于细菌。【结论】获得了小菜粉蝶颗粒体病毒(PiraGV)lef-3基因,通过生物信息学分析推测出了lef-3基因的起源进化规律。 展开更多
关键词 小菜粉蝶颗粒体病毒 晚期基因表达调控因子LEF-3 单链DNA结合蛋白 进化起源
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甲醛和苯并(a)芘联合作用对DNA损伤的体外研究
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作者 董红燕 刘君卓 陈冠英 《卫生毒理学杂志》 CSCD 1998年第3期146-148,共3页
以豚鼠肺巨噬细胞为研究对象,研究了甲醛和苯并(a)芘(BaP)在LD50、DNA-蛋白质交链(DPC)、DNA单链断裂(SSB)等3项指标上的联合作用。结果表明,甲醛和苯并(a)芘对豚鼠肺巨噬细胞的LD50分别为24... 以豚鼠肺巨噬细胞为研究对象,研究了甲醛和苯并(a)芘(BaP)在LD50、DNA-蛋白质交链(DPC)、DNA单链断裂(SSB)等3项指标上的联合作用。结果表明,甲醛和苯并(a)芘对豚鼠肺巨噬细胞的LD50分别为240.4mg/L和13.8mg/L,联合使用的LD50为61.7mg/L(其中甲醛为55.8mg/L,BaP为5.88mg/L),呈增强作用。甲醛能引起DPC,BaP不能引起DPC,联合作用时甲醛引起的交链程度降低;甲醛和BaP都能引起SSB,联合作用时SSB的程度增强。由此可见,甲醛和BaP对细胞杀伤和SSB具有增毒作用。 展开更多
关键词 甲醛 苯并(A)芘 DNA 蛋白质交链 肺巨噬细胞
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Cloning and Sequence Analysis of lef-3 Gene from Pieris rapae Granulovirus
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作者 MENG Xiang-kun GONG Cheng-liang XUE Ren-yu CAO Guang-li ZHU Yue-xiong 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2010年第5期681-689,共9页
To better understand the origination and evolution of lef-3 gene from baculovirus genome and determine the relationships between various viruses at molecular level, late expression factor 3 gene (lef-3) fragments of... To better understand the origination and evolution of lef-3 gene from baculovirus genome and determine the relationships between various viruses at molecular level, late expression factor 3 gene (lef-3) fragments of Pieris rapae granulovirus were obtained through conventional PCR method and sequenced after cloned into T-vector. Then, bioinformatics analysis on lef-3 gene and its encoding sequences were conducted by using bid-softs. Four mutations were appeared in the ORF of cloned lef-3 gene, which did not alter the characteristics of amino acids. It was inferred that PiraGV LEF-3 protein contained 399 amino acids, the molecular weight of which was 3.99 kD. Prediction of the LEF-3 advanced structure and homology comparison between other LEF-3 from various baculoviruses showed that the lef-3 gene might encode the single-stranded DNA-binding protein. The result of BLAST revealed that the lef-3 gene only existed in Lepidoptera host for the baculovirus genome, and the evolution analysis illustrated that lef-3 gene could be divided into 3 groups including one granulovirus (GV) group and 2 nucleopolyhedrovirus (NPV) groups. The selection pressure analysis of GV lef-3 gene coding region showed that the majority of lef-3 genes performed negative selection, while the Ka/Ks differed from different lef-3 gene, to some extent, which also performed positive selection. The origination analysis revealed that lef-3 gene of baculovirus might derive from bacteria. The lef-3 gene of PiraGV was cloned successfully and the possible patterns of origination and evolution were speculated through bioinformatics analysis. 展开更多
关键词 Pieris rapae granulovirus late expression factor 3 (LEF-3) single-stranded DNA-binding protein ssb evolutionary origin
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重组SSB蛋白表达、鉴定及评价 被引量:1
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作者 杜琴 卢小岚 +7 位作者 王强 汪光蓉 罗文依 王舒琪 姚丽华 张国元 刘剑平 王东生 《重庆医学》 CAS 2019年第14期2438-2442,共5页
目的构建SSB蛋白原核表达质粒,在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化。方法以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSB-6*Hi... 目的构建SSB蛋白原核表达质粒,在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化。方法以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSB-6*His-pet41a重组表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌OverExpress C41(DE3)中,经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用C端的His标签(Histag)进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,蛋白印迹法(WB)鉴定重组蛋白的免疫原性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其免疫反应性和特异性。结果 PCR扩增获得目的基因,菌落PCR示重组表达质粒构建成功,转化感受态OverExpress C41(DE3)后经诱导有高效表达,SDS-PAGE显示GST-SSB-6*His重组蛋白为上清可溶性表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与外周血中的抗SSB抗体发生特异性反应,特异性达100%。结论成功构建了GST-SSB-6*His-PET41a重组表达质粒,经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步建立应用于国产仪器的全自动定量检测抗SSB自身抗体的磁微粒化学发光试剂,奠定了基础。 展开更多
关键词 ssb 重组质粒 蛋白表达 蛋白鉴定
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腾冲嗜热菌单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3新的单链DNA结合特性(英文)
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作者 张树利 杨海花 +2 位作者 李磊 田宇清 谭华荣 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期453-459,共7页
【目的】揭示腾冲嗜热菌中两个单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3的全新的底物结合功能及其不同的体内表达模式。【方法】利用腾冲嗜热菌复制起始位点附近的长度较短的单链DNA为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot方法,研究SSB2... 【目的】揭示腾冲嗜热菌中两个单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3的全新的底物结合功能及其不同的体内表达模式。【方法】利用腾冲嗜热菌复制起始位点附近的长度较短的单链DNA为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot方法,研究SSB2和SSB3体外单链DNA结合特征和体内表达模式。【结果】SSB2与35nt的复制起始区单链DNA(ssDNA)结合,形成单个SSB2-DNA复合物;当与59ntssDNA结合时,可以随着蛋白浓度的递增形成一个或两个SSB2-DNA复合物;而与70nt的单链DNA结合时,则形成1~3个SSB2-DNA复合物。这些结果说明SSB2在与长度小于70nt的单链DNA结合时,存在着多种构型。而这些构型的形成取决于单链DNA的长度、蛋白的浓度,并与SSB蛋白所受的预处理温度和反应温度有关。SSB3与59nt和70nt结合时,最多形成3个或4个复合物。低温保存和高温下反应对SSB3蛋白的功能影响比SSB2更为显著,表现为构型明显减少或结合ssDNA能力下降。此外,在腾冲嗜热菌中,SSB2和SSB3的表达水平随温度变化而变化,SSB2在45℃~65℃间表达水平很高,在75℃时表达水平下降,而SSB3在45℃时表达水平较低,在55℃到75℃间表达水平较高,说明二者在腾冲嗜热菌中的表达可能受到培养温度的调控。【结论】腾冲嗜热菌中SSB2和SSB3具有全新的底物结合特征及其不同的体内表达模式。 展开更多
关键词 单链DNA结合蛋白 蛋白构型 蛋白表达模式
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