木本油料植物无患子SSR特征分析及SSR-PCR反应体系构建

无患子(Sapindus saponaria L.)是集生物柴油、药用、生态等多种用途于一体的经济型木本油料。本研究利用MISA软件挖掘了无患子叶片转录组中的SSR,对搜索到的SSR进行了特征分析,构建并优化了无患子SSR-PCR反应体系。结果表明,无患子叶片转录组共有Unigene条数目为52460条,其中含有SSR的Unigene有7014条,共检索到8654个SSR。经统计,SSR丰富度从二至六核苷酸依次减少,依次有4327、2669、634、208、161个。SSR长度范围在12~250 bp之间,长度小于等于15 bp的有3619个,均为二和三核苷酸;长度大于15 bp的有5035个,以二、三核苷酸居多。所有SSR共有435种不同重复单元。SSR不同类型重复基元频次分布在4~30次之间,主要分布在4~10频次,共有7090个SSR位点,占总频次的89.65%。SSR位点靶基因GO功能注释显示,无患子叶片转录组Unigene可分为3大类别51个小组;KEGG功能注释显示5大类别中,代谢通路占比最高为65.18%。通过对无患子SSR-PCR反应体系构建与优化,无患子SSR-PCR反应体系最佳组合为:循环次数37次、退火温度60℃、引物量2.0μL、DNA模板浓度为40 ng/μL。

党参基因组DNA提取、ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

对党参基因组DNA提取方法优化、ISSR体系形成及引物筛选三方面进行探讨,为研究党参居群遗传多样性及药材DNA鉴定奠定基础。经比较改良CTAB法、改进的高盐SDS法和试剂盒三种常用DNA提取方法,发现改良CTAB法效果最佳;利用优化设计并结合有关文献优化ISSR反应体系,最优反应体系为:50μL总反应体积中含约20ng DNA模板,1.25UTaq DNA聚合酶,2.25mmol.L-1Mg2+,200μmol.L-1dNTP,0.50μmol.L-1引物。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。

珍稀濒危植物大果木莲ISSR-PCR反应体系的建立

[目的]建立高效稳定的大果木莲ISSR-PCR反应体系。[方法]以珍稀濒危植物大果木莲新鲜嫩叶为材料,在高盐沉淀法提取高质量基因组DNA的基础上,通过ISSR-PCR反应体系中5个主要因素的单因子梯度试验,优化并最终建立了大果木莲稳定而高效的ISSR-PCR反应体系和反应程序。[结果]试验建立的大果木莲的ISSR-PCR反应体系为:20.0μl反应体系中含10×buffer2.0μl、Mg2+2.0 mmol/L、Taq酶0.5 U、DNA模板40 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs0.2 mmol/L和ddH2O13.3μl,其反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,50～60℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃完全延伸7 min。[结论]该研究为进一步揭示大果木莲群体的遗传多样性和遗传结构状况以及制定科学的保护措施提供了理论依据。

黔产苦参ISSR-PCR反应体系正交优化研究

[目的]确定适合苦参稳定的ISSR-PCR反应体系。[方法]采用经典的CTAB法提取苦参新鲜幼嫩叶片DNA;针对Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶进行正交设计L_(16)(4~5),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系。[结果]最适ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 90 ng、0.4μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg^(2+)、TaqDNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L d NTPs。[结论]建立的苦参ISSR-PCR反应体系,经过19份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析。

甜菜SSR—PCR反应体系优化及基于DNA混合池的SSR引物快速筛选

应用L16（4^4）正交设计对影响甜菜SSR—PCR的主要参数进行优化，建立适于甜菜的SSR反应体系和扩增程序。20ul反应体系中含有模板70ngDNA，150umol／LdNTP，0．7umol／LSSR引物，0．5TaqDNA聚合酶／U，10×PCRBuffer（含Mg^2＋）2．0ul。以选择的87对SSR引物为对象，对10个甜菜基因组DNA样品等量混合，进行PCR扩增筛选引物，结果表明，与常规筛选方法相比，DNA混合池方法大幅度缩短了实验周期，显著减少了实验资源的消耗，可用于大量甜菜SSR引物的快速高效筛选。

油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立

油松是我国特有的重要乡土针叶树种，开发合适的油松PCR-SSR引物并建立优化的反应体系，是开展油松天然群体和种子园人工群体遗传研究的基础．该研究以油松总DNA为材料，分析了Taq聚合酶、样本浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度以及引物浓度对PCR-SSR扩增结果的影响，筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物12对，建立了稳定的、可重复的油松PCR-SSR最佳反应体系及PCR扩增参数．研究结果表明：在15pLSSR-PCR反应体系中，样本最适宜浓度为30ng，Mg^2＋的最适浓度为0．25mmol/L，dNTP最适浓度为0．2mmog/L，单引物的最适浓度均为250nmol／L；Taq聚合酶在15止反应体系中宜加入0．375U．统计利用所选12对引物，对辽宁兴城油松种子园内49个建园无性系进行了SSR-PCR反应，通过6％的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，每对引物扩增产物在100—250bp之间的等位谱带数最大为10，最小为5，不同无性系间DNA谱带多态性丰富,油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立，为今后利用SSR标记技术开展油松种子园的父本分析及选择性受精研究提供了一个标准化程序和强有力的工具.

云南松SSR-PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR-PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR-PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×Taq PCR Buffer,模板DNA用量30 ng,Taq聚合酶用量1.0 U,0.2 mmol·L-1dNTPs,3.0 mmol·L-1Mg2+以及正、反引物各0.2μmol·L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4 min;94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸10 min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。

水稻SSR-PCR反应体系的优化

[目的]为了探索水稻最佳SSR-PCR反应体系。[方法]以水稻R117为试验材料,研究Mg2+、dNTP、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量以及退火温度对水稻SSR-PCR扩增结果的影响。[结果]当Mg2+浓度2.00 mmol/L,dNTP浓度0.15 mmol/L,引物浓度0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量2.0 U,退火温度56.6℃时,PCR扩增DNA条带最亮。[结论]在20μl反应体系中,上述结果为水稻最适SSR-PCR反应体系。

利用正交设计优化白桦的SSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对白桦SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SSR-PCR反应的最佳体系(20μL):DNA100ng,Mg2+浓度为3mmol·L-1,Taq酶0.5U,dNTP浓度为0.5mmol·L-1,引物浓度为0.4μmol·L-1。对白桦SSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火温度,得到的最佳退火温度为59.9℃。

马铃薯SSR标记多重PCR反应体系优化研究

以马铃薯品种克新18为试验材料,探讨了多重PCR反应体系主要成分、引物不同比例关系及退火温度对SSR标记扩增的影响。在不改变其他成分浓度的条件下,对PCR反应体系的4个组分(Taq酶、MgCl2、模板DNA、dNTPs)进行浓度或用量梯度试验;利用正交设计L(934)对反应体系的4对引物组合(STM0014、Pat、SSI、UGP)在3个水平上进行优化;最终确立了马铃薯SSR标记多重PCR反应优化体系,总体积为20μL;2.5μL 25 mmol.L-1 MgCl2,0.6μL 10 mmol.L-1 dNTPs,Taq酶0.8 U,模板DNA 80 ng;4 mmol.L-1的4对引物之间的用量比为2:1:2:3,退火温度为54.7℃。优化后的反应体系重复性好,扩增结果稳定可靠,能够明显区分不同的马铃薯品种。为进一步探讨马铃薯品种资源遗传多样性、构建DNA指纹图谱打下了坚实的基础。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20μL)为:15ng模板DNA,0.15mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1ISSR引物,1UTaq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。

甜樱桃品种SSR-PCR反应体系的优化

以甜樱桃品种那翁为试材,研究了樱桃SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:在PCR反应体系中,DNA最适浓度30～45ng;Mg2+的最适浓度范围为1.5～3.0mmol/L;dNTP最适浓度为0.2～0.3mmol/L;引物的最适浓度为0.3～0.4μmol/L;Taq聚合酶在20μl反应体系中宜加入0.5U。利用此反应体系,对24份樱桃代表资源进行了SSR反应,用6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,扩增产物在100～250bp之间,不同品种间DNA谱带多态性丰富。琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富。

杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用

为了探究杜仲多居群的遗传多样性,通过开展正交试验,建立了适合杜仲的ISSR-PCR反应体系,筛选出了14条多态性较高的有效引物,分析了杜仲的遗传多样性;共扩增出108个多态性位点,多态性位点的百分率为100%,有效等位基因数ne为1.505,Nei’s期望杂合度He为0.308,Shannon多态性的信息指数I为0.472。文中初步揭示出杜仲具有较高的遗传多样性,试验结果表明了ISSRs标记技术适用于杜仲的遗传多样性研究。

杜仲SSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为了对杜仲种质资源的遗传多样性研究奠定理论和技术基础,采用正交试验设计和单因素分析,建立并优化了杜仲的SSR-PCR反应体系。结果表明,杜仲SSR-PCR最适反应体系为正反向引物(10μmol.L-1)各0.2μL,Taq DNA聚合酶(5 U.μL-1)0.1μL,dNTP(10 mmol.L-1)0.2μL,模板DNA(5～10 ng.μL-1)1.0μL,Mg2+(25 mmol.L-1)0.6μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC超纯水6.7μL,总体积10.0μL。同时筛选出了3对多态性有效引物,研究结果证明了微卫星引物在不同物种间的通用性受物种间亲缘关系远近的影响,并初步揭示了杜仲的遗传多样性,表明了微卫星标记在遗传多样性研究上的优越性。

玄参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立稳定的玄参ISSR-PCR反应体系,本试验采用5因素（dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、引物及模板）5水平正交设计筛选PCR体系,并利用单因子梯度进一步优化反应体系各因素浓度和扩增程序（退火温度、延伸时间和循环次数）。结果表明：在20μl反应体系中含10×buffer,0.3 mmol/L dNTPs,0.5-1.0 UTaq DNA聚合酶,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,150 ng模板,扩增效果最好。PCR扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,50-61℃退火（退火温度随引物不同而变化）45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。从而建立了适合玄参的ISSR-PCR反应体系,为采用ISSR-PCR分子标记技术研究参种质资源遗传多样性提供了技术依据。

油茶SSR-PCR反应体系建立与优化

油茶是我国特有的木本食用油料树种,本研究采用正交试验和单因素试验,建立并优化了油茶SSR-PCR反应体系。结果表明,油茶最适SSR-PCR反应体系为模板DNA（5~10 ng.μL-1）1.0μL,Mg2＋（25 mmol.L-1）0.7μL,dNTP（10 mmol.L-1）0.15μL,正反向引物均为（10μmol.L-1）0.2μL,Taq DNA聚合酶（5 U.μL-1）0.1μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC水6.65μL,总体积10.0μL;同时证明了微卫星位点在山茶属（Camellia L.）植物的种间通用性。研究结果将为油茶遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析以及重要农艺性状的QTL研究提供重要的理论依据和技术支持。

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16（54）正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分TaqDNA聚合酶、样本浓度、Mg2＋浓度d、NTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系。研究结果表明：在20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶宜加入1.5 U,样本最适宜浓度为30-40 ng,Mg^2＋的最适浓度为1-1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L。用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠。

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR—PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2+和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选。结果确定了星星草ISSR—PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存。20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2+2.0mmol/L。

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿（Medicago sativa L．）ISSR—PCR的主要参数，建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为：15ng模板DNA，0．2mmol／LdNTP，0．4μmol／LISSR引物，0．8U Taq DNA聚合酶，2μL 10×PCR Buffer，1．5mmol／L MgCl2，2．5％去离子甲酰胺。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃（62℃～58℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共11个循环，每个循环退火温度降1℃；94℃变性30s，52℃（52℃～48℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共24个循环；72℃延伸5min，25℃保温。