甜菜SSR—PCR反应体系优化及基于DNA混合池的SSR引物快速筛选

应用L16（4^4）正交设计对影响甜菜SSR—PCR的主要参数进行优化，建立适于甜菜的SSR反应体系和扩增程序。20ul反应体系中含有模板70ngDNA，150umol／LdNTP，0．7umol／LSSR引物，0．5TaqDNA聚合酶／U，10×PCRBuffer（含Mg^2＋）2．0ul。以选择的87对SSR引物为对象，对10个甜菜基因组DNA样品等量混合，进行PCR扩增筛选引物，结果表明，与常规筛选方法相比，DNA混合池方法大幅度缩短了实验周期，显著减少了实验资源的消耗，可用于大量甜菜SSR引物的快速高效筛选。

云南松SSR-PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR-PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR-PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×Taq PCR Buffer,模板DNA用量30 ng,Taq聚合酶用量1.0 U,0.2 mmol·L-1dNTPs,3.0 mmol·L-1Mg2+以及正、反引物各0.2μmol·L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4 min;94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸10 min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析:①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20滋l)为:Taq酶1.0U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA50￣200ng,dNTP0.15mmol/L,引物0.3滋mol/L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58.3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

马铃薯SSR标记多重PCR反应体系优化研究

以马铃薯品种克新18为试验材料,探讨了多重PCR反应体系主要成分、引物不同比例关系及退火温度对SSR标记扩增的影响。在不改变其他成分浓度的条件下,对PCR反应体系的4个组分(Taq酶、MgCl2、模板DNA、dNTPs)进行浓度或用量梯度试验;利用正交设计L(934)对反应体系的4对引物组合(STM0014、Pat、SSI、UGP)在3个水平上进行优化;最终确立了马铃薯SSR标记多重PCR反应优化体系,总体积为20μL;2.5μL 25 mmol.L-1 MgCl2,0.6μL 10 mmol.L-1 dNTPs,Taq酶0.8 U,模板DNA 80 ng;4 mmol.L-1的4对引物之间的用量比为2:1:2:3,退火温度为54.7℃。优化后的反应体系重复性好,扩增结果稳定可靠,能够明显区分不同的马铃薯品种。为进一步探讨马铃薯品种资源遗传多样性、构建DNA指纹图谱打下了坚实的基础。

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20μL)为:15ng模板DNA,0.15mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1ISSR引物,1UTaq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR—PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2+和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选。结果确定了星星草ISSR—PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存。20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2+2.0mmol/L。

玄参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立稳定的玄参ISSR-PCR反应体系,本试验采用5因素（dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、引物及模板）5水平正交设计筛选PCR体系,并利用单因子梯度进一步优化反应体系各因素浓度和扩增程序（退火温度、延伸时间和循环次数）。结果表明：在20μl反应体系中含10×buffer,0.3 mmol/L dNTPs,0.5-1.0 UTaq DNA聚合酶,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,150 ng模板,扩增效果最好。PCR扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,50-61℃退火（退火温度随引物不同而变化）45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。从而建立了适合玄参的ISSR-PCR反应体系,为采用ISSR-PCR分子标记技术研究参种质资源遗传多样性提供了技术依据。

油茶SSR-PCR反应体系建立与优化

油茶是我国特有的木本食用油料树种,本研究采用正交试验和单因素试验,建立并优化了油茶SSR-PCR反应体系。结果表明,油茶最适SSR-PCR反应体系为模板DNA（5~10 ng.μL-1）1.0μL,Mg2＋（25 mmol.L-1）0.7μL,dNTP（10 mmol.L-1）0.15μL,正反向引物均为（10μmol.L-1）0.2μL,Taq DNA聚合酶（5 U.μL-1）0.1μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC水6.65μL,总体积10.0μL;同时证明了微卫星位点在山茶属（Camellia L.）植物的种间通用性。研究结果将为油茶遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析以及重要农艺性状的QTL研究提供重要的理论依据和技术支持。

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿（Medicago sativa L．）ISSR—PCR的主要参数，建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为：15ng模板DNA，0．2mmol／LdNTP，0．4μmol／LISSR引物，0．8U Taq DNA聚合酶，2μL 10×PCR Buffer，1．5mmol／L MgCl2，2．5％去离子甲酰胺。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃（62℃～58℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共11个循环，每个循环退火温度降1℃；94℃变性30s，52℃（52℃～48℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共24个循环；72℃延伸5min，25℃保温。

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol.L-1MgCl2;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。

中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化

芒属植物(Miscanthus)被认为适合作为新一代能源作物开发利用而成为当前国内外研究热点之一。为给后续相关研究奠定基础,本研究从中国芒属植物的芒(Miscanthus sinensis)、五节芒(M.floridulus)、荻(M.sacchariflo-rus)、南荻(M.lutarioriparius)、尼泊尔芒(M.nepalensis)、双药芒(M.nudipes)和红山茅(M.paniculatus)等类群中挑取部分材料,以其基因组DNA为模板,采用同一试验考察多个因素及水平的筛选方式对ISSR-PCR扩增体系中的Mg2+、dNTP、引物、模板的浓度以及循环数进行优化,建立适用于中国芒属植物的最佳ISSR-PCR反应体系。该体系为20μL,含Mg2+2.5mmol.L-1,dNTP 0.25mmol.L-1,引物0.5μmol.L-1,DNA 2μL及1UTaq Plus DNA聚合酶和1×PCR buffer。结果将为进一步开展中国芒属植物的相关遗传分析研究提供技术参考。

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。

狗牙根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种ISSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4μmol/L引物,0.5 mmol/L Mg2+,0.05 mmol/L dNTPs,0.2 U Taq DNA聚合酶,2.0μL 10×buffer.反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。

珍稀濒危植物五小叶槭ISSR-PCR反应体系的建立和优化

五小叶槭为珍稀濒危植物,在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。本研究采用2XTaqMaster Mix,综合考虑Taq酶、Mg^(2+)和d NTPs,对影响五小叶槭ISSR-PCR反应的3个因素(DNA模板、引物和Master Mix)进行3水平正交试验,从而优化出五小叶槭ISSR-PCR反应最佳体系。结果表明,引物用量对反应结果影响最大,其次为DNA模板,2XTaqMaster Mix对反应结果影响最小。最佳反应体系(25μL)为:DNA模板(50 ng·μL^(-1))1μL,引物2μL,2XTaqMaster Mix 13. 5μL。

快速微量提取番茄DNA及SSR-PCR反应体系的优化

以番茄叶片为试材,采用改进的CTAB法,电钻研磨,提取过程中加入醋酸铜,设计4因素3水平的正交试验对PCR反应体系进行优化,同时利用梯度PCR对退火温度进行选择选择。结果表明:优化的10μL反应体系含:1×buffer,1.2 mmol/L Mg2+,1.5 mmol/L dNTPs,1.2μmol/L引物,0.75 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA。扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,49.2℃退火30 s,68℃延伸30 s,共35个循环;最后72℃延伸8 min。优化的反应体系可以用于SSR分子标记机的研究,在所有SSR引物中基本都能有效扩增;改进的CTAB法提取的DNA纯度更高。

小桐子SSR-PCR反应体系的优化

采用改良的CTAB法从小桐子嫩叶中提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和SSR-PCR扩增检测,结果表明,改良CTAB法提取的小桐子基因组DNA完整性好,纯度较高,可作为SSR分子标记的模板。同时,对影响小桐子SSR-PCR扩增的d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物及Mg2+浓度等4个因素进行了优化,优化后的小桐子SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中含有模板DNA 100 ng,d NTPs 0.2 mmol·L^(-1),Taq DNA聚合酶100 U·m L^(-1),引物0.6μmol·L^(-1),Mg^(2+)1.5 mmol·L^(-1)。适宜的扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,51~53℃(退火温度随引物不同而改变)退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸10 min。

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2+1.8mmol/L、1×Buffer2μL、dNTP0.2mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10ng/μL。扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性40s,52℃退火45s,72℃延伸1.50min,共39个循环;72℃完全延伸5min,4℃保持。该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件。