小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１８，ＩＬ１８）是一种能诱导ＩＦＮγ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ１８（ｍＩＬ１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５α高效表达。

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达

目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为55kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。

人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆。亚克隆至经N heⅠ、H indⅢ酶切的PCDNA 3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T 3细胞中表达,经W estern-b lot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以EL ISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA 3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCB I基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经W estern-b lot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kM r,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA 3.1(+)/hTERT-hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌诱导家猪免疫应答

目的 观察猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌口服灌胃和肌肉注射家猪后诱导的免疫应答.方法 12头40日龄健康家猪随机均分为3组,每组4头.口服灌胃组每猪灌胃1011 CFU重组双歧杆菌[溶于50 mL双歧杆菌液体培养基（MRS）],肌肉注射组每猪于猪后腿肌肉注射1011CFU重组双歧杆菌（溶于10 mL MRS）,对照组每猪灌胃50 mL MRS.每次间隔2周,共免疫2次.于免疫后0、2、4、6和8周进行前腔静脉采血,采用ELISA法检测猪血清免疫球蛋白G（IgG）水平;制备猪外周血淋巴细胞（PBMC）,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测猪PBMC增殖水平;收集粪便,测定分泌型免疫球蛋白A（sIgA）水平.结果 与免疫前和MRS对照组相比,口服灌胃组和肌肉注射组猪血清IgG水平、PBMC增殖水平均在免疫后2～8周升高,6周达较高水平;粪便sIgA水平在免疫后2～8周升高,4周达较高水平,差异均具有统计学意义（P＜0.05）.口服灌胃组的IgG、sIgA水平和PBMC增殖水平显著高于肌肉注射组（P＜0.05）.结论 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌可诱导家猪产生有效的免疫应答,其免疫效果口服灌胃优于肌肉注射.

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体,并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中,构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38,经EcoR单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞,通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果经EcoR单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达,为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。

牛瑟氏泰勒虫p23-IL-18融合基因的原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗的可行性,以p23-IL-18融合基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组质粒pET-28a-p23-IL-18,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,构建牛瑟氏泰勒虫pET-28a-p23-IL-18原核表达质粒,目的基因在大肠杆菌中获得表达,融合蛋白的分子量约为48 kDa,并被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,具有良好的反应原性。此结果为牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗的制备提供了理论依据。

核18SrRNA编码基因的多态性表明立枯丝核菌种复合体中菌丝融合群 10区别于其他类群的遗传特性(英文)

用 11个限制性内切酶处理代表 11个已报道的立枯丝核菌的菌丝融合群的 2 5个种内类群的 16 1个样品 ,来研究 18S核rRNA的基因区的DNA多态性。该研究采用基于PCR的限制性图谱方法 ,即对酶催化的DNA扩增片段和亚片段用 1个或 2个限制性内切酶进行酶切。从这 2 5个种内类群构建了 4种类型的DNA限制性图谱 ,18SrDNA区段的图谱类型Ⅰ代表立枯丝核菌种内类型的大多数分离物 ,图谱类型Ⅱ和Ⅲ分别代表种内类群 2E、9分离物和 5C分离物 ,它们与图谱Ⅰ的区别在于图谱类型Ⅱ少一个限制性位点 ,图谱类型Ⅲ少 2个位点。图谱类型Ⅳ代表种内类群 10A和B(或者菌丝融合群 10 ) ,该图谱表现出重要的限制性位点多样性 ,即与其余的种内类群或菌丝融合群相比 ,该区段具有 5种酶切位点 ,在 18rRNA基因的 2 5个限制性位点中有 10个具有信息的位点 ,并被用来进行分析。以前报道的 5 8SrRNA基因片段包括转录内间隔区在内的限制性图谱被用来和这些片段逐一对准 ,有 12个具有信息的限制性位点被鉴定出来。这些数据被单独或混合用于研究类群的相互关系 ,通过最大相似性和似然法分析表明 ,菌丝融合群 (AG) 10明显与这个种复合物中的其他菌丝融合群的大多数分离物不同 ,且关系较远。

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体。方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A-HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上。结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础。

Cas9融合RAD18因子提高HEK293T细胞的定点敲入效率

【目的】在哺乳动物细胞中,RAD51和RAD18是调节同源定向修复和非同源末端连接的关键因子。本研究目的在于探讨这2个因子在eSpCas9系统中对HEK293T细胞的定点敲入(Knock-in,KI)效率的影响,进而提高KI效率。【方法】通过构建eSpCas9-RAD51、eSpCas9-RAD18融合蛋白以及过表达RAD51、RAD18载体,比较它们的KI效率差异。【结果】eSpCas9-RAD18系统可以显著提高HEK293T细胞KI效率,约为原来eSpCas9系统的1.4~1.9倍(P<0.01),而e Sp Cas9-RAD51系统和过表达RAD51/RAD18对KI效率无显著提高作用。【结论】本研究构建的eSpCas9-RAD18系统可以有效地提高HEK293T细胞的KI效率,可为基因编辑、基因治疗及定点转基因提供一种新的辅助整合工具。

抗菌肽CAP18在大肠杆菌中表达、纯化及活性的初步鉴定

根据抗菌肽CAP18活性片段的氨基酸序列,采用SOE技术,设计合成了CAP18的编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行序列测定后亚克隆至pET-32a(+)表达载体中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白CAP18。经Ni2+亲和层析后回收CAP18融合蛋白,纯度达到了85%以上。对纯化的融合蛋白进行酶切,用液体生长抑制方法检测切割后样品的活性,结果表明重组抗菌肽CAP18对大肠杆菌具有抑制活性。

人参皂苷在治疗因CLDN18-ARHGAP26表达引起的耐化疗药治疗过程中的抗肿瘤作用

目的探究胃癌细胞中CLDN18-ARHGAP26融合突变基因引起的耐化疗药的作用,并探究人参皂苷在治疗因CLDN18-ARHGAP26融合突变基因表达引起的耐化疗药治疗过程中的抗肿瘤作用。方法采用免疫磁珠抗体标记胃癌细胞系BGC-823的侧群(SP)细胞和非侧群(NSP)细胞,选出NSP细胞转染过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的慢病毒载体。用qPCR检测细胞中CLDN18-ARHGAP26融合突变基因和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)mRNA水平的表达。用Western blot检测转染上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-Cadherin、Vimentin的表达。用CCK-8检测转染细胞对化疗药奥沙利铂的敏感性。用CCK-8检测人参皂苷对转染细胞耐药性的影响。人参皂苷处理转染细胞后Western blot检测转染细胞的钙黏蛋白E(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达。结果qPCR检测显示转染过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因慢病毒载体的NSP细胞中CLDN18-ARHGAP26融合突变基因表达高于未转染组,ABCG2 mRNA表达高于未转染组(P<0.001)。Western bolt显示过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的NSP细胞中E-Cadherin蛋白表达低于未转染组(P<0.05),Vimentin蛋白表达高于未转染组(P<0.01),转染细胞对奥沙利铂的敏感性低于未转染组(P<0.05)。人参皂苷和奥沙利铂同时处理转染细胞,细胞存活率低于单纯奥沙利铂处理(P<0.05)。人参皂苷处理转染细胞后E-Cadherin蛋白表达高于未处理组(P<0.01),Vimentin蛋白表达低于未处理组(P<0.05)。结论人参皂苷能逆转胃癌细胞中CLDN18-ARHGAP26融合突变基因表达诱导的细胞EMT转化和奥沙利铂的耐药性。

突变型人IL-18的肿瘤靶向性改造及真核表达

为了构建肿瘤靶向性的人突变型IL18新基因并进行真核表达,以重组PCR技术构建EGFIL18融合基因,利用BactoBac杆状病毒表达系统和Sf9昆虫细胞株(来自秋天草地夜蛾)表达融合基因,纯化表达产物,并以IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验初步评价融合蛋白的生物活性。测序证明构建的融合基因为原设计EGFIL18融合基因。SDSPAGE和Westernblot证明EGFIL18融合基因在昆虫细胞中获得表达,表达的融合蛋白的Mr约为20000,与理论值相符,纯化后融合蛋白具有特异的IL18单抗结合活性。IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验显示,该融合蛋白具有肿瘤导向性和抗肿瘤活性。表明对突变型IL18成功地进行了肿瘤导向性改造并使其在真核细胞获得表达。

IL-18-PE38真核表达质粒的构建及表达

目的构建含有白细胞介素18(Interleukin18,IL-18)及毒素融合基因的真核表达质粒,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38(Pseudomonas exotoxin A)融合基因插入真核表达载体Psec Tag2B中,构建真核表达质粒Psec Tag2B-IL-18-PE38,重组质粒经限制性内切酶及PCR测定证实构建成功后,用脂质体介导法将其转染小鼠NIH3T3细胞中,然后用免疫荧光技术鉴定其表达。结果经酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因已被正确地插入真核表达载体Psec Tag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在其中表达。结论成功构建了重组的真核表达载体Psec Tag2B-IL-18-PE38并在体外细胞株获得表达,为下一步动物实验打下基础。

CD56异常表达的鼻咽低分化滑膜肉瘤1例报告

滑膜肉瘤(synovial sarcoma,SS)属于双向分化的软组织肉瘤,而低分化滑膜肉瘤(poorly differentiated synovial sarcoma,PDSS)主要体现为小圆细胞形态,其形态学、免疫组化及影像学特征均不显著,而原发于鼻咽的低分化滑膜肉瘤则鲜见报道,本文报道1例鼻咽原发伴CD56异常表达的PDSS,结合临床资料及文献重点分析其影像学改变、组织学、免疫组化及分子病理学特征,以加深对此类罕见肿瘤诊疗的认识。

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。

猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress（DE3）中的表达、纯化和兔抗血清的制备

目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向克隆到pGEX—1λT表达载体上，构建重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18，再用重组质粒转化大肠埃希菌（E．col）ArcticExpress（DE3）。用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达情况，亲和层析纯化获得重组融合蛋白。用纯化的重组蛋白按0．5mg／只与弗氏完全佐剂（CFA）混合，于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射；2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合加强免疫，此后每隔10d按第2次免疫法重复加强免疫，第4次免疫后6d，采集兔心脏血并分离血清，立即纯化及制备抗血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，采用蛋白印迹（Western blot）法鉴定抗血清的特异性。结果全基因合成的TS045W-4B—TSOL18融合基因片段长度为789bp。酶切证实pGEX—TS045W-4B—TSOL18重组质粒成功构建，测序结果获得的基因片段大小为789bp，与预期大小相符。SDS—PAGE分析和亲和层析后显示，重组质粒在转化E．col ArcticExpress（DE3）后，获得了相对分子质量约为55×10。的重组融合蛋白，纯度为85％。EUSA测定兔抗血清的效价为1：512000，Westernblot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约为55×10^3处出现1条与预期大小-致的特异性条带。结论成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18及制备了高纯度的TS045W-4B—TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清。

重组鸡IFN-α-IL-18融合基因的酵母分泌表达及其抗IBDV活性研究

为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白抗IBDV活性,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeⅠ酶切线性化,电穿孔方法导入酵母Pichia Pastoris X-33感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,淋巴细胞转化试验初步检测表达产物生物学活性,鸡胚接种试验对表达产物的抗IBDV效果进行评价。结果表明,在酵母培养上清液中存在相对分子质量分别为22 000、23 000和43 000的目的蛋白,表达的IL-18和IFN-α-IL-18对鸡淋巴细胞具有明显的诱导转化作用(P<0.05)。IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P<0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P<0.05)。这为进一步开展IFN-α-IL-18融合蛋白的功能研究及其在鸡病毒性疫病防控中作用的探索奠定了基础。

肺原发性滑膜肉瘤11例临床病理分析及SS18-SSX融合基因检测

目的探讨肺原发性滑膜肉瘤(PPSS)的临床病理特征和SS18-SSX融合基因检测意义。方法回顾性分析11例PPSS患者临床病理资料,其中男8例,女3例,年龄19～56岁,主要症状有咳嗽、咯血及胸痛,X线表现为患侧肺野团块状阴影,CT检查显示病变呈圆形或卵圆形,边缘均光滑,未见毛刺征。对肿瘤进行免疫组化染色,并用荧光原位杂交法(FISH)检测SS18-SSX融合基因。结果 11例PPSS中7例为单相型滑膜肉瘤,由形态一致的长梭形细胞构成,细胞胞质稀少、边界不清,呈片或束状排列;4例为双相型滑膜肉瘤,由不同比例的上皮和梭形细胞成分构成,上皮成分形成腺样或裂隙样结构,或排列呈乳头状、巢状、条索状。免疫组化染色显示肿瘤细胞弥漫表达Vimentin、TLE-1、CD99和Bcl-2,不同程度表达CK、EMA;1例表达S100,1例表达CD34,2例表达SMA,均为局灶性表达;所有肿瘤细胞均不表达TTF1、STAT6、Desmin、CR、D2-40、CK5/6、WT-1。FISH检测显示11例PPSS中10例可见SS18-SSX融合基因。结论 PPSS是罕见的肺原发性恶性肿瘤,形态可呈单相型、双相型,故应与发生于肺的恶性间皮瘤、纤维肉瘤等肿瘤相鉴别,SS18-SSX融合基因检测联合免疫组化染色有助于明确诊断。

滑膜肉瘤

滑膜肉瘤(Synovial sarcoma,SS)是最常见的肉瘤之一,可发生在身体的任何部位,尤其好发于20~30岁青年人。形态学上,双相型SS最常见,其次是少数单向型SS及低分化型SS。SS具有特异性的t(X;18)(p11;q11)染色体移位。临床症状与肿瘤发生部位有关,一般表现为无痛性包块。诊断需要依据影像学资料。病理学检查包括特征性的SSX移位进行确诊。SS预后与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤部位、是否有转移有关。如果SS未发生转移,患者5年存活率较高。SS治疗需要临床多学科的共同参与。对于局限性的小肿块,外科手术是最有效的治疗方法。放疗,化疗或放化疗也在SS治疗中发挥作用,尤其是对于>5cm的较大肿块或SS发生转移的时候。特异性SSX融合基因和蛋白的靶向治疗等多种SS治疗方法尚在临床试验中。相信不久的将来对于滑膜肉瘤可能会开发出新的治疗策略。

原发性心脏滑膜肉瘤1例临床病理分析

滑膜肉瘤是一类具有间叶和上皮双向分化的恶性肿瘤,可发生于任何部位,好发于四肢深部软组织,而原发心脏的滑膜肉瘤非常罕见。临床主要表现为心腔阻塞、栓塞和填塞而引起的相应症状。当发生部位不典型时,诊断往往具有挑战性,确诊依靠组织病理学形态、免疫组织化学及分子遗传学检查(SYT-SSX融合基因改变)。我们对1例原发心脏滑膜肉瘤的临床资料、病理特征、治疗及随访进行分析,并复习相关文献,以提高临床医师及病理医师对该病的认识。