同工酶分析法鉴定ST细胞系的研究

为鉴定ST细胞系的种属和纯净性,选用乳酸脱氢酶(LD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和核苷酸磷酸脱氢酶(NP)三种同工酶对ST细胞系进行了同工酶鉴定分析。结果显示:ST细胞系与猪睾丸原代细胞的三种同工酶谱带一致,不存在别的杂带,表明该ST细胞系与猪睾丸原代细胞同种,且不存在其他细胞的交叉污染。本研究可为其他动物源细胞的种属鉴定和交叉污染检测提供借鉴。

ST细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)引进ST细胞系,扩大培养后液氮冻存建立了种子细胞库和工作细胞库;细胞复苏后对细胞的活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行了研究。结果表明,ST细胞系呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、病毒、支原体检测均为阴性;染色体为19对;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库,可为开展ST细胞及猪瘟疫苗的研究提供基础理论依据和细胞资源。

三种紫色作物花色苷对ST细胞单层生长的影响

为揭示花色苷对猪睾丸细胞(ST)单层生长的影响,实验以黑加仑、黑豆皮、笃斯越桔三种作物花色苷为研究试材,处理ST细胞,光学显微镜观察不同花色苷处理后ST细胞生长情况,探索花色苷对细胞生长的最适浓度。结果表明:不同浓度的花色苷对ST细胞生长的影响不同,低浓度促进细胞生长,高浓度对细胞具有毒性。不同作物花色苷对ST细胞生长的影响也不同,笃斯越桔的最终安全浓度为100μg/mL,黑加仑、黑豆皮分别为30、40μg/mL。研究结果可进一步拓展花色苷功能性研究,为抑制病毒作用的细胞模型建立提供理论基础。

ST悬浮细胞系的驯化与猪细小病毒的培养

将贴壁的ST细胞驯化为可单细胞悬浮生长的细胞,并进行猪细小病毒大规模培养。采用逐步降低培养基中血清含量的方法获得可悬浮生长的ST-S细胞。结果表明,经悬浮驯化后的ST-S细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态,细胞呈圆球形,结团现象较少,胞体大小基本一致,生长速度正常,最大细胞密度可以达到每毫升4.5×106个细胞。说明经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的ST细胞株,为大规模工业化生产ST细胞提供技术支持。

猪细小病毒HLJ-DN株分离鉴定

按照常规病毒分离方法,从黑龙江省某猪场怀孕母猪所产死胎的肝脏中分离到一株病毒。利用ST细胞进行培养,通过血细胞凝集试验、间接免疫荧光试验及电镜观察等对新分离毒株进行鉴定。结果表明,该病毒能在ST细胞上生长并引起明显拉网状细胞病变,按Reed-Muench法计算出TCID50为10-4.6·0.1 mL-1;通过电镜观察可见直径约为20 nm无囊膜的病毒粒子,该病毒能凝集0.5%的豚鼠红细胞,免疫荧光试验显示在细胞上出现明显荧光,能与特异性抗体发生反应。对VP2基因进行扩增及测序并与GenBank已发表PPV毒株序列进行比对分析,结果显示该毒株与WB-143株在同一个分支里,同源性高达到99.8%,说明分离的病毒为猪细小病毒,命名为HLJ-DN,该病毒的分离为研究当地猪细小病毒的流行、预防和治疗奠定。

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖的研究

研究了猪伪狂犬病病毒(PRV)在ST、PK-15、CEF、BHK-21细胞系上的增殖情况。结果表明:4种细胞对PRV均敏感,PRV在4种细胞上增殖产生的病毒毒价分别为10^(-8.87±0.04)TCID_(50)/mL、10^(-8.50±0.03)TCID_(50)/mL、10^(-7.68±0.06)TCID_(50)/mL和10^(-7.87±0.05)TCID_(50)/mL。4种细胞都能产生明显的病变,但不同的细胞上出现病变不同,PK-15细胞(20±2)h出现细胞病变且病变为葡萄串状的细胞;ST细胞(22±2)h出现细胞病变且病变为细胞圆缩后成合胞体病灶;BHK-21细胞(25±1)h出现细胞病变且病变为细胞圆缩后成合胞体病灶,有拉网现象;CEF细胞(24±2)h出现细胞病变为葡萄串状的细胞。以上结果说明,ST细胞也适合用于PRV的增殖培养。