大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１，与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接，转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

大肠杆菌肠毒素ST_1、LT_B基因融合及其免疫原性研究

目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。

大肠杆菌K88ac,ST_1,LT_B基因融合

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因,再从含ST1-LTB融合基因的重组质粒pXSLT1中扩增出ST1-LTB融合基因,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pET-28KSL).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET-28KSL含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1,LTB单抗和K88ac抗体识别,表明已成功构建了K88ac-ST-LT融合基因,并实现了在重组大肠杆菌中的表达.

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合基因表达条件的优化

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含K88ac-ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下K88ac-ST1-LTB融合基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,同时以IPTG为诱导剂诱导K88ac-ST1-LTB融合基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度1.0 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间3 h,此时K88ac-ST1-LTB融合蛋白表达量为35.2%。本文实现了K88ac-ST1-LTB融合基因的高效表达,并为大肠杆菌肠毒素三价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1/K99/LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。

水稻基因ST1的克隆及原核表达

指出了基因ST1是决定水稻柱头和花柱形成的关键基因,属于水稻中的XHS基因家族.将ST1的全长cDNA序列构建到原核表达载体pET-28a中,并转化了表达菌株大肠杆菌BL21.经Western bolt验证表明:所表达80 kD蛋白即为目的蛋白,为后续的蛋白功能等研究提供了实验基础.

PCR在大肠杆菌ST1b基因扩增及其基因检测上的应用

作者应用聚合酶链反应(PCR)成功地扩增了产肠毒性大肠杆菌ST1b基因,在ST1b产量、活性和纯度上均满足了基因重组的要求。并利用PCR技术建立了一种新型基因探针标记方法(基因扩增标记法),所制备的ST1b基因探针经相关菌菌落杂交试验证实具有良好的特异性和敏感性。通过对180株婴幼儿腹泻大肠杆菌分离株、52株仔猪腹泻大肠杆菌分离株和28株大肠杆菌标准菌株的基因诊断以及96株K99—ST1b基因重组转化菌的基因检测,菌落杂交阳性率分别为11/180、2/52、2/28和5/96。

大肠杆菌肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆及其核苷酸序列分析

以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。