大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备

对已构建的重组菌株BL21(DE3)(pETXKSL3)进行鉴定,酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确.Western blot分析表明K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、K88ac和LTB抗体识别.以K88ac-ST1-LTB融合蛋白为抗原免疫蛋鸡制备卵黄抗体,ELISA法测定卵黄抗体效价可达1∶13 200.仔猪攻毒实验表明制备的卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为96%,上述研究结果说明K88ac-ST1-LTB多价卵黄抗体对由ETEC引起的新生仔猪腹泻具有很好的预防效果,从而为最终开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性。

仔猪大肠杆菌K_(88)-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的应用实验

对妊娠14－16周母猪颈部肌肉注射仔猪大肠杆菌K88－ST1－LTB三价基因工程灭活疫苗（以下简称三价灭活苗）的结果表明：三价灭活苗可以大大降低仔猪大肠杆菌的发病率和死亡率，差异极显著（P＜0．01）；对仔猪生长安全、无副作用；三价灭活苗的使用效果明显优于仔猪大肠杆菌K88－K99双价基因工程灭活疫苗（以下简称双价灭活苗）；疫苗现场应用免疫保护率明显高于双价灭活苗，差异极显著（P＜0．01）。

新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗生产工艺的研究

以实验室工艺为基础,用发酵罐培养,对培养基、诱导剂及诱导条件、通气量、菌液灭活条件等进行了筛选优化。结果表明,重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养的最适培养基为改良LB培养基;乳糖为适合于工业化生产的诱导剂,其最适浓度为100 mmol/L,诱导时间不低于6 h;2×105mL发酵罐培养的最佳通气量为500 L/min;培养菌液的灭活条件为按菌液总量加入4 mL/L甲醛溶液,37℃灭活48 h。按上述工业化生产条件生产疫苗5批,检验结果均安全有效。