Emery-Dreifuss肌营养不良症的临床、病理特征及emerin蛋白、STA基因的表达(附1例报告)

目的研究Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)的临床、病理特征及emerin蛋白、STA基因的表达。方法回顾性分析1例EDMD患者的临床资料及STA基因检测结果。结果本例患者儿童期发病,进行性四肢肌肉无力、萎缩,早期关节挛缩和心脏受累;血肌酶仅轻度增高;病理检查肌肉肌纤维大小不等,纤维变圆,部分被脂肪取代;脊髓前角细胞正常,腓肠神经无改变,除外神经源性肌萎缩;横纹肌与心肌emerin蛋白消失;STA基因无突变。结论EDMD是肌营养不良的特殊类型,发病早期出现关节挛缩和心脏受累;肌核膜emerin蛋白缺失;散发性EDMD的STA基因无突变。

STAT3基因SiRNA载体的构建及其对小细胞肺癌的影响

目的构建STAT3基因的SiRNA表达载体,并观察其对小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。方法根据STAT3序列设计SiRNA引物,构建SiRNA表达载体(STAT3-SiRNA-1,STAT3-SiRNA-2,STAT3-SiRNA-N)。应用Lipofect2000将STAT3-SiRNA表达载体转染NCI-H446细胞,流式细胞仪检测STAT3基因表达,噻唑兰法检测转染STAT3基因对小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。结果STAT3载体构建成功。转染STAT3-SiRNA-1、STAT3-SiRNA-2后,STAT3基因表达明显下降;转染STAT3-SiRNA-1、STAT3-SiRNA-2的细胞增殖能力明显低于转染STAT3-SiRNA-N和未转染的细胞(P<0.05)。结论成功构建了STAT3-SiRNA表达载体,该载体能有效抑制小细胞肺癌细胞STAT3基因的表达,与小细胞肺癌增殖活性有关。

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长,并进行序列比较研究。方法小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株,用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因,并采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长,并TA克隆到测序载体pMD18-T vector,测序结果与Karp标准株的同源性为99.4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功,为进一步构建表达载体,进行Sta56蛋白表达研究提供基础。

恙虫病东方体CMY株sta 56基因片段序列分析

目的 了解恙虫病东方体 Ｃ Ｍ Ｙ 株与其它株的关系。方法 测定 Ｃ Ｍ Ｙ 株 ｓｔａ５６ 基因片段的核苷酸序列并与其它株相应序列进行比较。结果 在测定的３２４ｂｐ 序列中， Ｇ Ｃ 含量为４３５ ％ ； 与 Ｋａｒｐ 、 Ｇｉｌｌｉａｍ 、 Ｋａｔｏ 、ｋｕｒｏｋｉ、 Ｋａｗａｓａｋｉ 及 Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉ 株相应序列的同源性分别为９１０ ％ 、８７３ ％ 、８７０ ％ 、８７３ ％ 、８６１ ％ 及７３８ ％ 。结论 Ｃ Ｍ Ｙ 株与已报道的恙虫病东方体菌株不同， 与 Ｋａｒｐ 株有很高的同源性。

恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体,为表达该基因奠定基础。方法:以恙虫病东方体Karp株基因组为模板,通过PCR方法扩增Sta22抗原基因,并将其克隆到表达载体pEASY-E2上,通过PCR方法及核苷酸测序进行鉴定。结果:所构建的原核表达载体携带Sta22基因,基因序列与GenBank上所公布的信息完全一致。结论:成功构建了Sta22抗原基因的原核表达载体,为研制和开发新型的恙虫病疫苗及临床诊断试剂奠定理论基础及物质保障。

恙虫病东方体sta56部分基因的克隆和表达

目的 构建恙虫病东方体sta5 6基因的重组表达质粒 ,并在E .coli中表达Sta5 6重组抗原。方法 从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta5 6基因的ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用TA克隆技术将此大片段克隆 ,并以重组质粒为模板 ,扩增编码Sta5 6抗原亲水氨基酸区的一段长 3 4 2bp的DNA ,插入 pProEXHTb载体 ,转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Westernblot进行分析。结果 从恙虫病东方体基因组中扩增出sta5 6基因的ORF ,以截短片段构建了重组表达质粒 pHTbOt3 4 2 ,SDS -PAGE显示蛋白表达带的分子量约为 15 .4kDa ,Westernblot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论 在大肠杆菌中表达的Sta5

恙虫病立克次体sta56基因片段的克隆

应用半套式PCR技术从Karp株恙虫病立克次体基因组中扩增出872hpDNA片段。该片段经Pstl消化后，与经PStl酶解的pUC18连接，转化大肠杆菌，电泳初筛得pUCRL3等重组质粒。pUCRL3经PCR及酶切证实含约294hp恙虫病立克次体sta56基因片段，可作为检测恙虫病立克次休的特异核酸探针。

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。

山东地区恙虫病东方体Sta56基因片段扩增与分型研究

目的 鉴定山东地区恙虫病东方体(Ot)基因型别。方法 采用巢式聚合酶链反应技术对23株恙虫病东方体山东株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病患者全血中提取的Ot目的基因进行分析研究,并与Gilliam、Karp、Kato国际参考株进行比较。将群引物扩增产物用双向测序法进行序列测定。结果 35份标本中33份属于Kawasaki型,2份(FXS4 and LHGM2株)属于Karp型。从这33份中选出B-16、FXS2株进行碱基序列测定,结果B-16、FXS2株Sta56基因片段序列与Kawasaki型同源性最高,分别为94.22％、95.21％,而与其他6株Ot同源性均<75.87％.应属于Kawasaki型;FXS4和HGM2株Sta56基因片段序列与Karp型同源性最高,分别为83.03％、96.45％,应属于Karp型。结论 山东地区恙虫病东方体流行株以Kawasaki型为主,但同时存在Karp型。

恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析

目的明确山东恙虫病东方体(Ot)分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增;选取4种内切酶HinfⅠ、HhaⅠI、HaeⅢ、PstⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP);对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序,运用Clustal X(5.0)和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树,进行比较分析。结果患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1.6 kbp的目的条带。Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、PstⅠ酶切后图谱一致,但与国际参考株Gilliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同;虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处,但存在酶切位点的突变。序列同源性分析结果显示,山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性最高,为97%,氨基酸序列同源性为92%。结论经Sta56基因全序列分析,Ot山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似,但也存在差异。

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体(Ot)情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性。方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定。结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带。对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份(LHGM2株)为Karp型。序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果:XDM2株首轮PCR产物碱基序列与。Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97．00％,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型; LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96．45％,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型。结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型。