分裂泛素化酵母双杂交系统研究信息素因子STE2蛋白相互作用

真菌的进化、分化及有性发育趋势受若干性别基因的调控,如交配型、信息素因子及异源三聚体G-蛋白ɑ-亚基基因等;同时,信息素因子调控真菌的有性生殖在酿酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类群,许多丝状子囊真菌属、种中含有信息素因子。在自然界中,匍柄霉属真菌大多数是以无性态的形式存在,但其中也有一小部分存在有性生殖阶段。为了深入研究信息素受体STE2及其相关基因对匍柄霉属典型种有性生殖的影响,本研究选取含有信息素因子STE2的匍柄霉属典型种Stemphylium eturmiunum为试验材料,克隆鉴定了信息素受体STE2,然后将其构建至诱饵蛋白表达载体上,并在cDNA文库初筛得到数个疑似互作蛋白片段基础上,克隆其基因全长构建至靶蛋白表达载体上,并利用分裂泛素化的膜酵母双杂交系统,进行一对一验证筛选STE2的相关互作蛋白。该研究筛选出的互作蛋白结果为后期的CO-IP、Poll-Down实验提供了基础。

橡胶树白粉菌MAT相关基因(STE2基因)的克隆及表达分析

以橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm)为材料,根据同源性克隆得到一个MAT相关基因的DNA和c DNA序列,命名为OH-MAT2。生物信息学分析表明,这个基因DNA全长为964 bp,具有一个921 bp的完整开放阅读框(ORF),编码307个氨基酸。其编码的蛋白质分子量为35 584.1,等电点为9.78,且是稳定的疏水性蛋白质。氨基酸序列分析该蛋白质具有STE2家族的保守结构域。结构预测表明该蛋白质主要有α-螺旋、β-折叠及转角构成。相对荧光定量显示该基因在侵染不同时段有表达,且差异明显。

酿酒酵母GPCR蛋白Ste2亚细胞定位信号探索

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项工作的目的在于确定Ste2亚细胞定位,探究Ste2不同跨膜域、胞内外环状结构域和N端、C端对其亚细胞定位的影响。构建了一系列结构域删除或替换突变体,通过荧光显微镜观察判断不同结构区域对Ste2亚细胞定位的影响,并通过与已知的细胞器标记蛋白共定位观察验证亚细胞定位判读结果。结果显示:野生型Ste2荧光信号出现在质膜和液泡内腔;C端缺失突变体荧光信号出现在质膜和内质网。在N端、C端、各环状结构域序列采用动物GPCR蛋白ORI7、OR17-40相应结构域替换的突变体中,C端替换导致液泡内腔信号消失,质膜信号强于野生型;N端和部分环状结构域替换不同程度减弱或消除了质膜定位,液泡腔内信号类似于野生型;部分突变体在胞内出现点状分布的荧光信号。由此推断:Ste2 N端,第一、第二胞外环状结构域和第三胞内环状结构域可能具有影响Ste2运输定位到质膜的功能;而C端则可能在Ste2离开细胞膜进入液泡的过程中发挥作用。初步确定了Ste2的不同结构区域对其定位的影响,为深入研究GPCR蛋白的亚细胞定位机制奠定基础。

Hippo通路蛋白在凝血酶活化的血小板中激活并调控体外血小板活化

目的:探讨Hippo通路蛋白在凝血酶刺激的血小板中的磷酸化水平,并探索其对血小板活化的影响。方法:免疫印迹法检测凝血酶活化的人血小板中Hippo通路蛋白—哺乳动物STE20样激酶1/2(MST1/2)、核Dbf2相关激酶1/2(NDR1/2)和MOB1的磷酸化水平;血小板聚集仪检测MST1/2抑制剂XMU-MP-1对血小板聚集的影响;流式细胞仪检测XMU-MP-1对血小板整合素αIIbβ3活化和CD62p表达的影响;血块回缩实验检测XMU-MP-1对血小板整合素“outside-in”信号的影响;免疫印迹法检测XMU-MP-1对血小板Hippo通路蛋白和p38磷酸化水平的影响。结果:MST1/2、NDR1/2和MOB1的磷酸化水平在凝血酶活化的血小板中显著升高(P<0.05);XMU-MP-1可抑制凝血酶诱导的血小板聚集和αIIbβ3活化(P<0.05),但不影响α颗粒释放和血块回缩;在XMU-MP-1处理的血小板中,凝血酶诱导的Hippo蛋白的磷酸化水平下降(P<0.05),而p38的磷酸化不受影响。结论:Hippo通路蛋白在凝血酶诱导的血小板中被激活,并参与血小板活化调控。

Hippo信号通路在缺血再灌注损伤中的研究进展

Hippo信号通路是一条进化保守,可调节器官大小和细胞迁移、分化、增殖和凋亡的信号通路。在哺乳动物体内,Hippo通路通过多种保守激酶相互作用来调节器官大小和细胞迁移、分化、增殖和凋亡。研究发现,Hippo通路与缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤密切相关,其核心组分哺乳动物Ste20样激酶1/2(Mammalian STE20-like kinase 1/2,Mst1/2)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)介导氧化应激、血脑屏障损伤、胶质细胞活化等过程,与线粒体动力学、细胞凋亡及瘢痕形成等紧密相关,参与I/R损伤的发生发展。因此,Mst1/2和YAP有望成为治疗I/R损伤的新靶点。本文以Mst1/2和YAP蛋白为研究核心,分别梳理Mst1/2和YAP蛋白在I/R损伤中的作用机制,为I/R损伤治疗寻找新思路。

Hippo通路核心组分MST1/2、LATS1/2在恶性肿瘤中的作用

Hippo信号通路是一条高度保守的生长控制信号通路,主要由一系列保守的激酶组成,其中核心组分哺乳动物STE20样激酶1/2与大肿瘤抑制激酶1/2常常被发现在肿瘤中低表达,推测其可能与肿瘤抑制具有相关性。本文综述了二者的生理作用及与恶性肿瘤的关系,期望对恶性肿瘤临床预防与治疗带来新的研究方向。