Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的建立及其功能初步研究

利用Tet-on调控系统,建立受强力霉素诱导STGC3基因表达的CNE2细胞系,为进一步研究STGC3的功能提供了一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-STGC3转染入CNE2细胞,并用G418和潮霉素分别进行两轮筛选,运用RT-PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度强力霉素诱导CNE2/Tet/pTRE-STGC3细胞,RT-PCR检测STGC3的表达,确定强力霉素的最佳诱导浓度.采用此浓度的强力霉素分别诱导CNE2、CNE2/Tet/pTRE、CNE2/Tet/pTRE-STGC3三组细胞,测定细胞的生长曲线、克隆形成率和细胞周期分布.诱导STGC3基因高表达,CNE2细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),克隆形成能力显著降低(P<0.01);流式细胞仪检测结果显示,瘤细胞群体中处于G0/G1期细胞数增加,细胞阻滞于G0/G1期.Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的成功建立,为进一步研究STGC3基因的功能提供一个理想的细胞模型.

STGC3基因缺失突变对CNE2细胞生长增殖能力的影响

为探讨鼻咽癌候选抑癌基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)对CNE2生长增殖能力的影响,应用基因定点突变技术将该结构域缺失,亚克隆至真核表达载体上,并将野生型及突变型STGC3稳定转染人鼻咽癌细胞系CNE2,检测其对CNE2细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、细胞集落形成能力和细胞周期分布.研究发现,LGdomain的缺失明显降低了STGC3的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性度显著增强,提示该结构域在STGC3发挥肿瘤抑制功能中起着重要作用.

雌激素对转STGC3基因CNE2细胞系生长增殖的影响

为探讨雌激素对STGC3基因抑瘤的促进作用,将重组的pcDNA3.1(+)-STGC3真核表达载体导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选,RT-PCR及蛋白质印迹检测STGC3的表达,获得稳定高表达STGC3基因的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系.采用细胞计数法,检测雌二醇(β-estradiol)对体外培养pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞生长增殖的影响.将pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞接种于裸小鼠前肢背部皮下,观察分析雌性与雄性裸鼠成瘤的差别.运用RT-PCR、免疫组织化学及蛋白质印迹方法,分别从mRNA及蛋白质水平,分析STGC3基因在裸鼠移植瘤组织中的表达状况.移植瘤组织病理切片检查,观察瘤细胞形态学变化.用流式细胞仪测定移植瘤组织的细胞周期分布.研究结果表明:细胞体外培养,pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞经β-estradiol处理后,其生长速度明显减缓(P<0.05);裸鼠体内研究,接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞实验组的移植瘤体积和重量均小于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);实验组中,雌性裸鼠组移植瘤体积和重量均小于雄性组,差异有显著性意义(P<0.05),雌性裸鼠组移植瘤生长最慢,而对照组中雄性与雌性裸鼠组间瘤块的差异无显著性意义(P>0.05);接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的雌性裸鼠组移植瘤,阻滞于G0/G1期细胞数大于其他各组(P<0.05).上述体内外研究结果显示,雌激素可能具有增强STGC3基因对CNE2细胞系的生长抑制作用.

Tet调控STGC3基因表达的CNE2细胞系裸鼠成瘤实验性研究

STGC3基因是一个新近克隆的肿瘤相关基因,前期的体外实验研究结果表明,STGC3基因在CNE2鼻咽癌细胞系高表达,可明显抑制CNE2的生长增殖.采用Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系接种于裸鼠皮下,以强力霉素(Dox)诱导STGC3基因高表达,观测STGC3基因高表达对CNE2裸鼠体内成瘤的影响,并探讨其可能作用机制.运用RT-PCR、蛋白质印迹及免疫组织化学方法,分别从mRNA和蛋白质水平,分析瘤组织中STGC3基因的表达;用流式细胞仪检测移植瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况;用免疫组织化学方法,检测移植瘤组织凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.研究结果显示,STGC3蛋白表达主要定位于细胞核内,Dox诱导STGC3基因在Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系高表达,Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系裸鼠体内成瘤受到明显抑制,与对照组比较,移植瘤成瘤时间晚、生长慢、肿块小、细胞凋亡率高,Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减少,差异有显著性意义(P<0.01).此体内实验研究结果与前期体外实验结果一致,进一步证明STGC3基因对肿瘤细胞生长具有抑制作用.

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。

PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究

目的:探讨PCR与双酶切技术联合使用鉴定阳性重组子的特异性和可靠性,评价长期保存的重组质粒再次测序的必要性。方法:对随机选取已经过测序验证的三组STGC3/pcDNA 3．1(+)、一组STGC3/pGEM Easy T Vector重组子首先经过LB氨苄平皿培养挑单克隆筛选,然后单独或联合使用PCR和双限制性内切酶BamH I和Xho I酶切方法鉴定,将阳性样品送交生物工程公司测序,比较并评价两者结果的一致性。结果:三组STGC3/pcDNA 3．1(+)重组子经PCR—双酶切检测阳性而不能通过测序,说明该检测方法在运用中确实存在假阳性,同时证明重组载体在长期保存后有必要再次鉴定。结论:保存过程中的杂菌污染、实验室操作中的质粒交叉污染以及重组载体基因突变是基因工程操作中不可忽视的问题;PCR—双酶切鉴定重组载体存在假阳性的问题,实验设计中应包含阳性与阴性(污染)对照,并有足够的重复实验。

STGC3基因高表达Daudi细胞系的建立与鉴定

目的探讨STGC3基因高表达对Daudi细胞形态、倍增时间和增殖速度的影响。方法采用电穿孔基因转染技术,将pCDNA3.1(+)/STGC3真核表达载体导入Daudi细胞系,G418筛选,建立高表达STGC3基因的Daudi细胞系,利用Western-blotting检测转基因细胞系中STGC3蛋白的表达;运用免疫细胞化学和HE染色方法及绘制细胞生长曲线,了解STGC3基因表达在Daudi细胞中的定位,以及对细胞倍增时间和增殖速度的影响。结果在转基因的Daudi细胞系中,STGC3蛋白高表达并定位于胞浆与胞核。转染STGC3基因后,Daudi细胞倍增时间延长,增殖速度明显减慢(P<0.05)。结论成功建立STGC3基因高表达Daudi细胞系。

STGC3基因突变载体的构建及其在CNE2细胞中的表达

目的:构建STGC3基因单碱基位点突变载体并观察CNE2细胞中STGC3蛋白表达情况,为探讨STGC3基因发挥抑瘤作用的功能性位点提供前期基础。方法:针对STGC3基因糖基化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化3个(656C、725C、913T)可能性功能位点,运用Stratagene定点突变技术,对STGC3基因656C、725C、913T位点分别进行单碱基定点突变,使656C突变为G,725C突变为T,913T突变为G,构建突变表达质粒,同时构建野生型质粒为对照。质粒经转化、抽提、酶切及测序鉴定。将重组真核表达质粒,用脂质体转染至鼻咽癌CNE2细胞系,经G418筛选,得到稳定表达STGC3基因3种突变型CNE2细胞系。实验设6组,即空白对照组(Negative control)、空载体组(Vector)、野生型组(His-STGC3)和3个STGC3基因突变型组(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G)。运用RT-PCR、免疫印迹及免疫细胞化学,观察重组质粒突变型STGC3基因是否正常表达。结果:突变质粒经酶切和测序鉴定,酶切结果显示目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确,成功构建带His标签的3个突变型(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T、His-STGC3-T913G)重组真核表达质粒。RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学结果显示,突变质粒均正常表达His-tag-STGC3基因及融合蛋白质,融合蛋白定位于细胞质和细胞核。结论:成功构建STGC3基因单碱基位点突变质粒,并在CNE2细胞中表达STGC3融合蛋白。

下调STGC3基因表达对NP69细胞增殖的影响

目的探讨STGC3基因在鼻咽癌发生发展中的作用机制。方法设计基于miRNA30框架的STGC3特异性shRNA,构建STGC3特异性miR30-shRNA真核表达载体pRNAT-U6/shRNA-STGC3,转染永生化人鼻咽上皮细胞系NP69;采用RT-PCR检测未转染、转pRNAT-U6空质粒和转pRNAT-U6/shRNA-STGC3组NP69细胞中STGC3基因mRNA的表达;使用流式细胞仪检测3组细胞周期分布与细胞凋亡情况。结果与未转染组和转pRNAT-U6空质粒组相比,转染pRNAT-U6/shRNA-STGC3的NP69细胞中STGC3基因mRNA表达下降(P(0.05),G0/G1期细胞比例下降,G2期和S期的细胞比例之和增加(P(0.05)。结论 miR30-based shRNA成功地下调了STGC3在NP69细胞系中的表达;STGC3基因在NP69细胞系的表达下调,使NP69细胞生长增殖速度加快,凋亡减少,提示STGC3对NP69细胞增殖具有抑制作用。

STGC3基因表达上调对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响

目的 采用蛋白质组学方法,分析STGC3基因高表达对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响。方法 应用脂质体转染技术,将pcDNA3.1 ( + ) STGC3的表达质粒导入鼻咽癌细胞系CNE2 ,经G41 8筛选、RT -PCR技术鉴定阳性克隆,建立稳定高表达STGC3的细胞系;采用双向凝胶电泳分离CNE2、pcDNA3.1 ( + ) CNE2和pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞的总蛋白质,图像扫描后用ImageMaster软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质点。结果 CNE2、pcDNA3.1 ( + ) CNE2和pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞的蛋白质点分别为675±2 7、660±2 3和662±1 8个,蛋白质点主要分布在等电点为3.5～8.5、分子量为2 2～80kD的范围内。去除空白载体所致的蛋白质的差异后,在pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞系中,确立了1 5个上调的蛋白质点和8个下调的蛋白质点。结论 STGC3基因高表达能引起鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变,此结果为进一步研究STGC3基因的抑瘤分子机制提供了很好的实验资料。

STGC3基因高表达对CNE2细胞放疗敏感性的影响

STGC3基因是一个鼻咽癌相关候选抑癌基因,其对鼻咽癌放疗的影响尚不清楚。本文通过构建STGC3基因高表达CNE2细胞系,探讨STGC3基因高表达对人鼻咽癌CNE2细胞放疗敏感性的影响及其可能的分子机制。成功构建和鉴定STGC3基因高表达CNE2细胞系(CNE2-RTP-hSTGC3-his)后,总剂量4 Gy的6 MV X线照射各组细胞。CCK-8结果显示实验组细胞(CNE2-RTP-hSTGC3-his)的活力较阴性对照组细胞(CNE2-RTP-his)和空白对照组细胞(CNE2)下降(P<0.05);凝胶电泳及质谱分析结果显示SFN蛋白、微管蛋白(TUBA1B)、钙联蛋白(calnexin)在X线照射后的表达增加。同时,与各对照组相比较,实验组细胞中的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和SFN蛋白的表达下降(P<0.05),而p62的表达量则升高(P<0.05)。实验表明,上调STGC3基因可能通过抑制SFN的表达而抑制放疗引起的CNE2细胞自噬,从而提高CNE2细胞对放疗的敏感性。

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定

目的:分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法:运用生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3种探针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析(EMSA)及染色质免疫共沉淀(ChIP)分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果:在STGC3基因核心启动子区存在21个转录因子结合位点,其中9个为Sp1转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含有转录因子结合位点5个,其中Sp1转录因子结合位点2个;EMSA和ChIP实验结果显示,STGC3基因中存在转录因子Sp1特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论:STGC3基因核心启动子区含有Sp1特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。