假定调控蛋白STM14_3514可降低鼠伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力

【目的】研究鼠伤寒沙门菌致病岛1(SPI-1)内部的假定调控蛋白STM14_3514的功能及其作用机制。【方法】以鼠伤寒沙门菌模式菌株ATCC 14028为亲本株,构建了STM14_3514基因的缺失突变体及互补菌株,通过小鼠实验、细胞侵袭实验、Western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等实验技术,深入研究了STM14_3514基因对鼠伤寒沙门菌致病过程的影响。【结果】STM14_3514突变提高了细菌对小鼠的致病能力,突变体在小鼠肠道、肝和脾中的定殖能力均增强;细胞实验揭示,突变体致病力提升主要由于STM14_3514突变能显著增强细菌对上皮细胞的侵袭力(>2倍,P<0.05)。q RT-PCR及Western blot分析表明,STM14_3514显著抑制SPI-1内部主要调控因子hil A及侵袭相关基因的表达。此外,STM14_3514对hil A的抑制由Hil C介导。【结论】STM14_3514是鼠伤寒沙门菌SPI-1内部的负调控因子,能通过Hil C抑制hil A及SPI-1其他入侵基因的表达,该基因的生物学意义可能与细菌进入细胞后对SPI-1的负调控相关。

鼠伤寒沙门菌中甲基化修饰调控PhoP活性的机制研究

目的·探究鼠伤寒沙门菌转录调控因子PhoP的甲基化修饰与其活性的相关性,筛选PhoP的甲基转移酶。方法·Westernblotting检测不同培养条件下鼠伤寒沙门菌中PhoP的甲基化水平变化。通过生物信息学预测候选的甲基转移酶,体内过表达预测的甲基转移酶后检测phoP及其下游基因的转录水平变化,找到可能的PhoP甲基转移酶,并体外验证该甲基转移酶能否甲基化PhoP。使用real-time PCR检测高浓度Mg^2+、弱酸性等培养条件下,phoP与其甲基转移酶在转录水平的相对表达变化。结果·随着培养基中Mg^2+浓度升高,PhoP甲基化水平上升;而经过弱酸刺激后,PhoP甲基化水平下降。生物信息学预测并筛选到9个甲基转移酶,其中体内过表达STM14_0023后,phoP及其下游基因的转录水平下降且PhoP蛋白水平也下降,但敲除STM14_0023对上述分子的表达无影响。体外甲基化酶促反应显示STM14_0023能够甲基化PhoP,体内过表达STM14_0023后也可提高PhoP的甲基化水平,且在抑制phoP表达的高浓度Mg2+培养条件下STM14_0023的转录水平升高。结论·STM14_0023是PhoP的甲基转移酶,甲基化修饰抑制PhoP活性。

鼠伤寒沙门菌STM14_3199过表达菌株的构建及转录组测序分析

目的 通过转录组测序技术比较鼠伤寒沙门菌未知功能蛋白STM14_3199过表达菌株(WT_3199)和鼠伤寒沙门菌ATCC14028株(WT)各基因转录的差异,为进一步探究STM14_3199的功能提供方向。方法 PCR扩增STM14_3199基因,插入表达载体pBAD24,电转化至WT中,获得STM14_3199过表达菌株WT_3199,将其与WT在相同的营养条件下培养至对数生长期,制样后进行转录组测序分析。结果 经PCR、SDS-PAGE电泳及测序验证证明过表达菌株构建成功,对转录组数据进行质控显示样本组数据合格,统计结果中的差异基因,发现共有1 906个表达量出现差异的基因,其中上调887个,下调1 019个。将差异基因按照功能分类,并注释到GO及KEGG数据库中富集分析,发现这些差异基因涉及许多通路,影响体内多种功能的发挥。结论 成功构建了STM14_3199过表达菌株WT_3199。WT_3199中表达量上调的基因主要集中在碳源利用、精氨酸的降解及合成等途径,部分下调基因在柠檬酸盐的利用以及精氨酸的分解代谢过程中发挥功能。GO富集分析表明差异基因主要与代谢过程、胞内组分以及一些酶的催化活性等有关,KEGG富集分析表明差异基因主要富集在与碳代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环等相关通路中。这些分析均提示我们STM14_3199可能在这些通路中发挥作用,为进一步研究其功能奠定了基础。