鸡Stra8基因真核表达载体构建及亚细胞定位的研究

试验旨在克隆苏禽黄鸡视黄酸激活基因8(Stra8)的cDNA序列,构建pEGFP-C1-Stra8载体并制备鸡Stra8抗体。通过RT-PCR克隆苏禽黄鸡Stra8基因cDNA,构建pEGFP-C1-Stra8和pcDNA3.1(+)-Stra8重组质粒,分别转染NIH-3T3细胞和免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光法检测抗体效价以及在细胞中的分布。结果显示,苏禽黄鸡Stra8基因cDNA全长645bp,共编码214个氨基酸,提交至GenBank获得登录号为JX204292.1;成功制备Stra8多克隆抗体,pEGFP-C1-Stra8融合蛋白在NIH-3T3细胞质中表达。该结果为深入探讨禽类Stra8生物学功能奠定了基础。

Am80和TSA对鸡Stra8基因启动子活性的调控作用

旨在确定鸡Stra8基因启动子的主要调控区域,预测调控元件结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8启动子活性的调控作用。将鸡Stra8基因5′侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic载体构建重组质粒,并转染DF-1和GC-1,通过检测荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取合适的启动子片段并构建其重组质粒Stra8-EGFP;将Am80和TSA分别按一定的浓度梯度诱导转染细胞,进行荧光素酶活性检测以筛选最佳诱导浓度;用最适剂量的Am80和TSA分别单独或联合诱导转染重组质粒Stra8-EGFP的P19,并检测各诱导组的绿色荧光表达程度。结果表明,鸡Stra8基因启动子-1 055^+54bp片段的活性较强,且含有RARα、RXRα和RARβ的结合位点;分别单独或联合使用Am80和TSA对转染的细胞进行诱导,结果显示,Am80和TSA协同作用的荧光素酶活性最高;重组质粒Stra8-EGFP转染细胞后,用Am80(10-5 mol·L-1)和TSA(10-6 mol·L-1)联合诱导可见绿色荧光强度最强。本研究成功分析了鸡Stra8基因启动子的活性和调控元件的结合位点,确定Am80和TSA共同诱导可显著提高Stra8基因启动子调控活性。

视黄酸及Stra8基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞分化的影响

旨在研究视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)及Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs)分化的影响。选用PCR方法鉴定雄性cESCs为研究对象,转染Stra 8基因,对Stra8基因阳性cESCs使用RA进行12d连续诱导,同时设立Stra8基因转染组、RA诱导组及空白组对照,各组均进行3次重复试验。细胞形态学、qRT-PCR检测RA及Sira8基因对cESCs分化的影响。结果表明。转染Stra8基因进行RA诱导,在诱导12d后,出现精原干细胞样的圆形小克隆,其他组cESCs出现类胚体或解体;qRT-PCR鉴定发现各组中干细胞标记基因表达量随着培养时间的延长逐渐下降,同时检测到生殖细胞相关基因表达,转染Stra8基因并使用RA诱导组中表达量均高于对照组(P<0.01),6d表达量达到最高,然后逐渐下降。Stra8基因和RA的联合作用能够促进cESCs向着生殖细胞方向的分化,不仅改变了原有细胞形态,同时出现了生殖相关基因的表达。通过该方法可以在体外建立一个。ESCs诱导分化模型,将为生殖细胞的发生、增殖、分化及调控机理的研究和人类不孕不育症的治疗奠定良好的基础。

3个地方猪品种BOLL和STRA8基因结构变异位点的群体分布研究

为了探讨BOLL-I6-sv285(15号染色体BOLL基因第6内含子)和STRA8-I4-sv447(18号染色体STRA8基因第4内含子)这两个结构变异在地方猪与欧洲猪品种中的群体分布差异,试验采用PCR方法对从江香猪、江口萝卜猪、荣昌猪和大白猪4个猪品种进行基因分型,并通过在线软件miRBase、UCSC、RegRNA 2.0对结构变异序列所含的功能元件进行分析。结果显示,BOLL-I6-sv285为一段285bp的插入,经群体验证,3个地方猪品种以DI和DD基因型为主,I等位基因的频率高于大白猪,插入基因型(II)对应较高的产仔数,基因型与从江香猪产仔数之间呈显著相关(P<0.05);STRA8-I4-sv447为一段447bp的插入突变,群体中DD基因型占优势,从江香猪、江口萝卜猪和大白猪的I等位基因频率高于荣昌猪,插入基因型(II)对应较低的产仔数,基因型与从江香猪产仔数之间呈显著相关(P<0.05)。本试验鉴定的BOLL-I6-sv285和STRA8-I4-sv447两个结构变异可作为从江香猪产仔数的候选分子标记。

小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)的原核表达及兔多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体。方法应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨酸标签(His-TAG)亲和层析柱纯化原核蛋白。以纯化后的Stra8蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备Stra8多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体的效价,Western blot法检测制备的抗体对睾丸组织Stra8蛋白的识别能力以确定其有效性,免疫荧光组织化学染色法检测睾丸组织中Stra8蛋白的表达以确定多克隆抗体的特异性。结果pET28a-Stra8重组质粒经双酶切和测序鉴定正确,经诱导后能高效表达Stra8蛋白,应用His-TAG亲和层析法获得纯度较高的Stra8蛋白。应用纯化的Stra8蛋白连续免疫新西兰大白兔5次后,提取抗血清,经ELISA检测获得的Stra8多克隆抗体效价为1∶106,Western blot法分析显示多克隆抗体可特异性地识别睾丸组织中的内源性Stra8蛋白,免疫荧光染色法显示该多克隆抗体能够特异性的识别小鼠睾丸组织精原细胞表达的Stra8蛋白。结论在大肠杆菌中有效地诱导表达Stra8原核蛋白并制备了特异性的兔抗Stra8多克隆抗体。

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用

microRNA(miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8(Stra8)在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。

维甲酸和Cyp26基因家族与生殖细胞分化

在哺乳动物胚胎期,成熟分裂首先在雌性生殖细胞启动,雄性生殖细胞则停滞于有丝分裂的G0/G1阶段。在小鼠的研究发现,成熟分裂启动时间很可能决定着生殖细胞的分化方向。另一方面,达到一定阈值浓度的维甲酸(RA)能够启动生殖细胞从有丝分裂到成熟分裂的过渡。体内RA的水平由其合成和降解速率调节,而Cyp26是调节体内RA水平最关键的酶。因此,这种由Cyp26调节的RA水平的变化可能从根本上调控着哺乳动物生殖细胞的分化方向(形成精原细胞或卵原细胞),最终影响性别的分化。本文主要综述RA、Cyp26基因家族在哺乳动物性腺分化过程中的作用,并探讨了低等脊椎动物特别是鱼类成熟分裂启动及生殖细胞分化的分子机制。

视黄酸激活基因Stra8对生殖细胞减数分裂起始的调节作用

Stra8(stimulated by retinoic acid gene8)是一种生殖细胞特异性表达并受视黄酸诱导的基因,它可有效促进生殖细胞启动减数分裂。Stra8是减数分裂起始的调节蛋白,参与了雌性胚胎期和雄性出生后生殖细胞的减数分裂起始过程。胚胎期睾丸减数分裂起始受阻是由于视黄酸降解酶CYP26B1和发育相关调节蛋白Nanos2抑制Stra8表达的结果。Stra8与生殖细胞减数分裂起始的研究有助于人们对精子生成和卵子发育的深入理解。