SULT1A3与芹菜素的磺酸化结合反应的动力学特征研究

目的：研究人重组酶SULT1A3与芹菜素的磺酸化结合反应的动力学特征。方法采用高效液相色谱法，测定芹菜素的消除量及其磺酸化结合反应代谢产物的生成量，并应用LC－MS／MS液质联用技术鉴定其结构。建立芹菜素与重组酶SULT1 A3体外反应体系，测定SULT1A3催化不同浓度芹菜素的磺酸化结合反应代谢速率，采用GraphPad Prism 5软件对其进行酶动力学分析。结果芹菜素在0．15625～30μM范围内线性关系良好，平均回收率大于80％，日内和日间的RSD均小于15％。芹菜素与SULT1A3孵育体系中的代谢产物为单磺酸化结合产物。芹菜素与人重组酶SULT1A3的反应呈底物抑制动力学特征。芹菜素与SULT1A3酶反应的动力学参数Km和Ksi分别为（0．355±1．04）、（23．62±0．06）μM，Vmax为（65．71±1．30） nmol／（min· mg），Vmax／Km为185．10 mL／（min· mg）。结论人重组酶SULT1A3可介导芹菜素的磺酸化结合反应，且其酶动力学特征呈现底物抑制效应。推测由SULT1A3介导的磺酸化结合反应可能在芹菜素的体内II相代谢中发挥重要的作用。

SULT1A3、ERα、ERβ在子宫肌瘤组织中的表达及其与子宫肌瘤发病的相关性分析

目的探讨SULT1A3、ERα、ERβ在子宫肌瘤组织中的表达及其与子宫肌瘤发病的相关性分析。方法通过对子宫肌瘤组(行子宫切除术的患者32例)和正常组(子宫下垂严重,行子宫切除术的患者20例)的病理切片组织,采用免疫组织化学、Western blot、qRT-PCR检测的方法,对SULT1A3、ERα、ERβ蛋白和mRNA水平进行分析。结果子宫肌瘤组中SULT1A3、ERα的阳性表达为65.63%和96.88%,正常组中SULT1A3、ERα的阳性表达为100%和70%,子宫肌瘤组中SULT1A3低于正常组(P<0.01),子宫肌瘤组中ERα高于正常组(P<0.05),正常组中ERβ的阳性表达为35%,子宫肌瘤组ERβ的阳性表达为65.63%,正常组中ERβ显著低于子宫肌瘤组(P<0.01),正常组中SULT1A3蛋白灰度值表达高于子宫肌瘤组(P<0.05),正常组中ERα、ERβ蛋白灰度值表达低于子宫肌瘤组(P<0.05),在子宫肌瘤组中SULT1A3与ERα的表达呈现负相关(P<0.05),ERα与ERβ呈正相关(P<0.05)。结论SULT1A3水平升高,会促使ERα表达降低,从而减弱子宫肌瘤发病的发生和发展。

miR-373通过靶向调控SULT1A3表达影响芹菜素磺酸化代谢反应特性

目的:探讨微小RNA-373(microRNA-373,miR-373)通过调控SULT1A3的表达对芹菜素磺酸化代谢反应速率的影响。方法:通过在人结肠腺癌细胞Caco-2 TC7中转染miR-373 mimic构建miR-373高表达细胞模型;应用qRT-PCR方法检测miR-373高表达后细胞中SULT1A3 mRNA的表达水平;建立细胞裂解液与芹菜素反应体系,应用HPLC法测定各转染组中不同浓度(2.5,10和30μmol·L-1)芹菜素的代谢速率,并结合LC-MS/MS鉴定芹菜素及其代谢产物结构。结果:在miR-373高表达的Caco-2 TC7细胞中,SULT1A3的mRNA表达受到抑制;与阴性转染组(mimic negative control组,mimic NC组)相比,miR-373转染组(miR-373 mimic组)中不同浓度芹菜素的代谢速率下降(P<0.05);LC-MS/MS显示芹菜素代谢产物为单磺酸化结合产物。结论:miR-373通过靶向抑制SULT1A3,降低芹菜素的磺酸化代谢反应速率。

SULT1A3及HEK-SULT1A3细胞催化甘草素(7-OH)磺酸化代谢动力学的研究

该文采用酶孵育法,测定了甘草素在SULT亚型酶中的代谢活性,并通过活性-蛋白表达相关性分析,评价了SULT1A3在甘草素(7-OH) SULT代谢中的作用。结果发现各亚型酶均能催化甘草素生成7-O-SULT代谢物,代谢动力学均符合米氏方程模型。根据内在清除率(CLint),不同亚型酶催化甘草素(7-OH)发生SULT代谢的活性大小依次为SULT1C4>SULT1A3>SULT1E1>SULT1A1>SULT1A2>SULT1B1>SULT1C2>SULT2A1。相关性分析结果显示,甘草素(7-OH)代谢速率与SULT1A3蛋白水平呈显著性相关(P<0. 05)。此外,构建了SULT1A3高表达的HEK293细胞(HEK-SULT1A3细胞),并能代谢甘草素生成代谢物。甘草素在HEK-SULT1A3细胞中的代谢动力学同样符合米氏方程模型[Vmax为(0. 315±0. 009)μmol·min-1·g-1,Km为(7. 04±0. 680)μmol·L-1,CLint为(0. 045±0. 005) L·min-1·g-1],且HEK-SULT1A3细胞催化甘草素(7-OH)的代谢动力学特征与SULT1A3重组酶催化甘草素(7-OH)的代谢动力学特征具有显著相关性(P<0. 001),验证了该细胞具有SULT1A3的功能。结果表明甘草素易于发生SULT代谢,SULT1A3在甘草素(7-OH) SULT代谢中发挥关键作用,SULT代谢可能是导致甘草素生物利用度低的重要原因。此外,成功构建了HEK-SULT1A3细胞,为研究甘草素SULT代谢提供了一个细胞模型,可用于更加准确地预测甘草素体内SULT代谢过程。

白杨素在人小肠S9中磺酸化结合反应的代谢特性

目的研究白杨素分别与人重组酶SULT1A3和人小肠S9(human small intestine S9,HSI S9)孵育体系磺酸化结合反应的代谢特性。方法采用高效液相色谱法,测定白杨素及其代谢产物,并应用LC-MS/MS液质联用技术鉴定其结构。分别建立白杨素与重组酶SULT1A3及与人小肠S9的反应体系,测定不同浓度的白杨素在不同酶反应中的代谢速率。结果白杨素与SULT1A3及人小肠S9孵育体系反应的代谢产物均为单磺酸化结合产物。白杨素与重组酶SULT1A3及人小肠S9的酶反应均呈双相动力学特征。白杨素与SULT1A3酶反应的动力学参数Km为(3.06±1.04)、(0.41±0.06)μM,Vmax为(12.13±1.30)、(6.72±1.61)nmol/(min·mg),Vmax/Km为3.96、16.39 mL/(min·mg)。白杨素与人小肠S9的酶反应的动力学参数Km为(1.92±0.35)、(0.01±0.00)μM,Vmax为(0.52±0.02)、(0.08±0.02)nmol/(min·mg),Vmax/Km为0.27、8.00 mL/(min·mg)。重组酶SULT1A3和人小肠S9分别介导的白杨素磺酸化结合反应的代谢呈现显著的相关性(R2=0.985)。结论 SULT1A3在白杨素的肠道代谢中发挥主导作用,小肠可能是白杨素的主要代谢器官。