巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。

SAE1与SAE2蛋白相互作用肽抑制剂的多种体外筛选体系的构建与评价

目的·构建用于发现小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)的活化酶亚基1(SUMO-activating enzyme subunit 1,SAE1)与亚基2(SUMO-activating enzyme subunit 2,SAE2)相互作用的肽抑制剂的多种体外筛选体系,并对不同筛选体系的优势与不足进行评价。方法·将编码SAE1和SAE2的目的基因分别插入pET-28a载体以构造原核蛋白表达质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化人源SAE1和SAE2蛋白;利用纯化的蛋白先后构建等温滴定量热检测(isothermal titration calorimetry,ITC)实验、荧光偏振(fluorescence polarization,FP)实验、表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验和基于SAE酶活的荧光实验等多种筛选体系。尝试利用不同的筛选体系检测候选多肽的抑制活性,基于检测结果,从灵敏度、稳定性、检测通量和检测成本等维度评价各筛选体系的优缺点与适用性。结果·经ITC测得SAE1和SAE2蛋白在体外相互作用的解离常数(K_(d))为0.96μmol/L,并将活性最好的多肽PEPT7改造为FP实验的示踪剂(tracer),但同SAE2的亲和力无法满足FP的要求;SPR测得SAE1和SAE2相互作用的K_(d)值为1.13μmol/L,与ITC数据接近;基于SAE酶活的荧光实验筛选得到抑制活性最强的多肽HP1B[半数抑制浓度(half-maximalinh ibitory concentration,IC_(50))达15.72μmol/L],SPR进一步确定其同SAE1的亲和力为34.4μmol/L。结论·尝试构建并比较了多种常见的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)抑制剂的筛选体系。其中,ITC的检测通量低,且难以准确评估结合热不显著的低亲和力多肽;FP体系的可行性高度依赖于示踪剂同靶点蛋白之间的强亲和力,同样无法用于低亲和力多肽的筛选与优化;SPR检测的灵敏度高,但检测成本较高;酶活实验兼具高灵敏度、稳健性、高通量和可接受的检测成本,是最适宜的筛选方法。