LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析

【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a;LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 mg/mL浓度的LwaCas13a蛋白。荧光检测结果显示,LwaCas13a蛋白具有明显的反式切割活性,为商业化Cas13a蛋白活性的1.25倍,且LwaCas13a蛋白与CrRNA的最佳结合比例为1∶2。【结论】试验成功表达纯化出高纯度、高浓度的LwaCas13a重组蛋白,其反式切割活性优于商业化Cas13a蛋白,并明确了该蛋白与CrRNA的最佳配比,为利用LwaCas13a进行动物病毒RNA检测新技术的研发提供了依据。