SAE1与SAE2蛋白相互作用肽抑制剂的多种体外筛选体系的构建与评价

目的·构建用于发现小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)的活化酶亚基1(SUMO-activating enzyme subunit 1,SAE1)与亚基2(SUMO-activating enzyme subunit 2,SAE2)相互作用的肽抑制剂的多种体外筛选体系,并对不同筛选体系的优势与不足进行评价。方法·将编码SAE1和SAE2的目的基因分别插入pET-28a载体以构造原核蛋白表达质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化人源SAE1和SAE2蛋白;利用纯化的蛋白先后构建等温滴定量热检测(isothermal titration calorimetry,ITC)实验、荧光偏振(fluorescence polarization,FP)实验、表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)实验和基于SAE酶活的荧光实验等多种筛选体系。尝试利用不同的筛选体系检测候选多肽的抑制活性,基于检测结果,从灵敏度、稳定性、检测通量和检测成本等维度评价各筛选体系的优缺点与适用性。结果·经ITC测得SAE1和SAE2蛋白在体外相互作用的解离常数(K_(d))为0.96μmol/L,并将活性最好的多肽PEPT7改造为FP实验的示踪剂(tracer),但同SAE2的亲和力无法满足FP的要求;SPR测得SAE1和SAE2相互作用的K_(d)值为1.13μmol/L,与ITC数据接近;基于SAE酶活的荧光实验筛选得到抑制活性最强的多肽HP1B[半数抑制浓度(half-maximalinh ibitory concentration,IC_(50))达15.72μmol/L],SPR进一步确定其同SAE1的亲和力为34.4μmol/L。结论·尝试构建并比较了多种常见的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)抑制剂的筛选体系。其中,ITC的检测通量低,且难以准确评估结合热不显著的低亲和力多肽;FP体系的可行性高度依赖于示踪剂同靶点蛋白之间的强亲和力,同样无法用于低亲和力多肽的筛选与优化;SPR检测的灵敏度高,但检测成本较高;酶活实验兼具高灵敏度、稳健性、高通量和可接受的检测成本,是最适宜的筛选方法。

SUMO-1共价修饰ataxin-3

为了探讨ataxin-3的正常生理功能以及脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病机理,采用酵母双杂交技术,选择polyQ扩展突变型ataxin-3全长构建诱饵质粒,筛选成人脑cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质,筛选到互作蛋白smallubiquitin-likemodifier1(SUMO-1).进一步运用免疫共沉淀技术证实,SUMO-1在哺乳动物细胞中共价修饰野生型和polyQ扩展突变型ataxin-3.免疫荧光共定位实验发现,polyQ扩展突变型ataxin-3形成的核内蛋白聚合体与SUMO-1共定位.研究提示,ataxin-3的正常生理功能可能受SUMO-1的调节,SUMO-1可能参与了脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病机制.

SUMO-1基因在肝癌中的表达及意义

目的研究肝癌传代细胞、肝癌标本及癌旁肝组织中SUMO-1基因的表达及意义。方法采用RT-PCR、Westernblot方法在mRNA及蛋白水平检测肝癌传代细胞、肝癌标本及癌旁肝组织中SUMO-1基因的表达。结果在mRNA及蛋白水平,SUMO-1基因在肝癌传代细胞SMMC-7721、Hep3B、HepG2及肝癌标本中均明显高表达,而癌旁肝组织中SUMO-1基因明显低表达,肝癌组织和癌旁肝组织中SUMO-1表达差异有统计学意义(P<0.001)。结论SUMO-1基因在肝癌中高表达,SUMO-1可能为肝癌诊断和治疗中的一个靶点。

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清。方法从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础。

SUMO-1基因沉默对肝癌细胞株SMMC-7721 bcl-2及c-myc基因表达的影响

目的探讨SUMO-1基因沉默后对肝癌细胞株SMMC-7721bcl-2及c-myc表达的影响。方法将人工合成的针对人SUMO-1基因的siRNA片段转染人肝癌细胞株SMMC-7721,采用RT-PCR、Westernblot方法检测siRNA沉默SUMO-1基因的效果及SUMO-1基因沉默后对bcl-2及c-myc基因表达的影响。结果人工合成的针对SUMO-1基因的siRNA片段能显著地抑制SMMC-7721SUMO-1基因的表达,24、48、72h沉默率分别为9.80%、73.43%、46.56%。SUMO-1基因表达下调后SMMC-7721细胞内bcl-2及c-myc基因表达也明显下调,差异有统计学意义。结论 siRNA是一种理想的沉默SMMC-7721SUMO-1基因表达的方法,SUMO-1基因沉默后SMMC-7721细胞内的bcl-2及c-myc基因表达均明显下调,说明SUMO-1基因控制癌基因bcl-2及c-myc的表达。

SUMO-1 siRNA对肝癌细胞SMMC-7721 p53基因表达的影响

目的:研究肝癌细胞SMMC-7721中SUMO-1基因对突变型p53基因表达的影响,及SUMO-1基因对肝癌细胞增殖的作用.方法:通过将有效的人工合成的SUMO-1 siRNA转染肝癌细胞SMMC-7721后沉默SUMO-1基因的表达.通过RT-PCR及Western blot实验来观察SUMO-1基因表达下调后对SMMC-7721中突变型p53基因表达的影响.通过MTT实验来检测SUMO-1siRNA转染SMMC-7721后在24、48及72h对细胞增殖的影响.结果:在SMMC-7721中,SUMO-1和突变型p53基因均高表达.SUMO-1基因表达下调后,SMMC-7721中突变型p53基因在mRNA及蛋白水平同步表达下调,24、48及72h表达下调率分别为5.73%±0.61%、69.43%±1.22%及57.71%±0.94%.细胞增殖明显受到抑制,24、48及72hSMMC7721增殖抑制率分别为70.96%、71.57%及81.56%.结论:在转录水平,SUMO-1基因控制突变型p53基因的表达,并和突变型p53基因共同控制SMMC-7721细胞的增殖.

SUMO-1基因rs7580433多态性与非综合征性唇腭裂的关联研究

目的:研究SUMO-1基因rs7580433的多态性与中国人群非综合征性唇腭裂(NSCLP)的相关性。方法:从国际人类基因组单体型图计划(HapMap)选取来自中国北京汉族人群的多态位点rs7580433为研究位点,在183名NSCLP患者和162名健康正常人对此位点进行基因分型从而进行病例-对照研究。结果:NSCLP患者的GA基因型频率比正常对照组明显降低,其差异有统计学意义(P=0.025)。结论:SUMO-1基因rs7580433位点的基因多态性与中国人群NSCLP易感性相关。

SUMO-1在HIF-1/VEGF信号通路中作用

目的研究SUMO-1在低氧激活的HIF-1/VEGF信号通路中作用。方法构建稳定表达SUMO-1的细胞系,采用荧光显微镜观察SUMO-1的细胞内定位,利用Western blot检测在低氧培养细胞中SUMO-1和HIF-1α的表达;利用荧光素酶报告基因实验检测SUMO-1对依赖于HIF-1的报告基因表达的影响。结果 SUMO-1主要分布在细胞核中,低氧可以上调SUMO-1的表达,SUMO-1可以上调HIF-1α的表达,促进依赖于HIF-1的荧光素酶报告基因的表达。结论低氧可能通过上调细胞中SUMO-1的表达,进而稳定HIF-1α或者上调HIF-1α的表达,增强HIF-1的转录活性。

SUMO-1 mRNA诊断肝癌的价值研究

目的研究肝癌中SUMO-1mRNA表达水平及诊断肝癌的应用价值。方法采用RT-PCR检测外科切除的肝癌、癌旁肝组织、肝血管瘤及肝局灶性结节性增生标本中SUMO-1mRNA表达水平,并比较肝癌与癌旁肝组织,甲胎蛋白（AFP）阴性与阳性的肝细胞性肝癌,肝良、恶性肿瘤之间SUMO-1mRNA表达水平的差异。结果 SUMO-1mRNA在肝癌及癌旁肝组织中均有表达,但在肝癌中的表达水平明显高于癌旁肝组织;在不同AFP水平的肝细胞性肝癌中SUMO-1mRNA均高表达,差异无统计学意义;在肝血管瘤及肝局灶性结节性增生中SUMO-1mRNA也有表达,但表达水平明显低于肝癌。结论在不同AFP水平的肝细胞性肝癌中SUMO-1mRNA均高表达,而在癌旁肝组织及肝良性肿瘤中表达较低,SUMO-1mRNA可作为诊断肝癌的一个重要标志物。

类泛素家族SUMO-1和UBC9的克隆、融合表达及纯化

目的:克隆类泛素化家族SUMO-1和UBC9基因,表达并纯化二者与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增SUMO-1和UBC9的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-SUMO-1和pGST-UBC9,分别转化大肠杆菌DH5α,表达融合蛋白GST-SUMO-1和GST-UBC9;用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果:分别构建了SUMO-1和UBC9的融合表达载体;Western印迹检测表明,GST-SUMO-1和GST-UBC9融合蛋白获得表达;纯化得到了融合蛋白。结论:克隆、表达并纯化了SUMO-1和UBC9与GST的融合蛋白。

SUMO-1修饰因子的作用

SOMO-1作为一个修饰因子,主要作用是翻译后的调控,对基因表达及基因组的稳定性具有意义。SOMO-1通路普遍存在于真核细胞中,并参与细胞内信号通路的调节。本文综述了SUMO-1修饰在各方面的作用。

缺氧应激中SUMO-1的作用

SUMO-1并不引起靶蛋白降解,而是通过翻译后修饰,保护蛋白免受泛素化降解、影响细胞内的定位和蛋白与蛋白之间的相互作用。由SUMO-1介导的HIF-1α的翻译后修饰,可以调控HIF-1α的稳定性,并参与细胞内信号通路的调节。综述了SUMO-1修饰在缺氧应激中的作用。

布鲁氏菌LPS及VirB2缺失株对巨噬细胞SUMO-1表达及Ubc-9转录水平的影响

为了初步探究布鲁氏菌众多毒力因子对小鼠巨噬细胞中类泛素SUMO-1和偶联酶Ubc-9表达的影响,本研究使用经提纯的布鲁氏菌16M脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)以及布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的VirB2缺失株侵染小鼠巨噬细胞,在不同时间段收集细胞,提取细胞总RNA和细胞总蛋白,通过qRT-PCR和Western blot技术分别检测类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平。结果表明,不同浓度的布鲁氏菌16M脂多糖LPS侵染小鼠巨噬细胞后,细胞中类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平均未发生明显变化;布鲁氏菌VirB2缺失株与阴性对照组相比,类泛素SUMO-1的表达水平和偶联酶Ubc-9的mRNA的转录水平在各侵染时间段差异具有显著统计学意义(P<0.05),可初步判定在宿主细胞中,布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统会影响类泛素SUMO-1蛋白的表达水平和Ubc-9mRNA的转录水平,从而在胞内稳定繁殖。

沉默SUMO-1基因对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响

目的探讨siRNA干扰SUMO-1基因表达对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响,旨在为子宫内膜癌基因治疗提供新的靶点。方法设计针对SUMO-1基因的siRNA转染Ishikawa细胞;采用实时荧光定量RT-PCR和Western-blot检测转染效果;MTT及流式细胞术检测转染siRNA后,细胞的增殖及周期情况。结果转染SUMO-1 siRNA明显抑制Ishikawa细胞增殖,细胞周期被阻滞于G1期,由G1期向S期进展延缓(P<0.05)。结论 SUMO-1 siRNA能有效抑制Ishikawa细胞增殖,SUMO-1有望成为子宫内膜癌基因治疗新途径。

SUMO-1在ApoE-/-小鼠PM_(2.5)暴露中调控血管HIF-1α/VEGF信号通路的研究

以气管滴注方法研究了Apo E-/-小鼠经PM_(2.5)暴露后,其主动脉弓中SUMO-1、HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)表达变化规律及HIF-1α的SUMO化修饰情况.实验结果显示:PM_(2.5)暴露后,小鼠主动脉SUMO-1、HIF-1α、VEGF的表达上调;PM_(2.5)暴露诱导了SUMO-1对HIF-1α的SUMO化修饰;低氧条件下SUMO-1敲低导致HIF-1α表达的下调.结果提示PM_(2.5)暴露通过上调细胞中SUMO-1的表达,稳定或者上调HIF-1α的表达,进而影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达,造成动脉粥样硬化斑块的不稳定.

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12h内呈现下降趋势,在12h后开始上升,极显著高于正常水平(P<0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。

SUMO-1与PML-NB

泛素相关小修饰蛋白-1(small ubiquitin-related modifier-1,SUMO-1)作为一个修饰因子,主要作用是翻译后的调控,对基因表达及基因组的稳定性具有意义。SUMO-1可共价修饰早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白,是后者定位到核体(nuclear body,NB)的前提。SUMO-1修饰的PML-NB能够进一步招募其他蛋白质,从而调节其功能,其中SUMO可以作为PML/p53通路中的一种调节蛋白。当PML作为转录催化因子与p53结合时,会抑制肿瘤细胞生长,并激活p53的促凋亡活性。另外,GFP-SUMO-1的过表达能阻止PML-NB的微结构形成,其原因是从PML修饰中转变成了SUMOylation形式,从而SUMO-1在调节PML核体的完整性上起了重要作用。本文主要综述了SUMO-1与PML及PML-NB的关系。

SUMO-1 mRNA在诊断胆囊癌中的价值研究

目的研究胆囊癌中SUMO-1基因mRNA的表达水平及在胆囊癌诊断中的应用价值。方法采用RT-PCR的方法检测外科切除的胆囊癌、癌旁肝组织、胆囊腺瘤样息肉中SUMO-1基因mRNA的表达水平并比较胆囊癌和癌旁胆囊组织之间、CA19-9阴性和阳性的胆囊癌之间、胆囊良恶性病变之间的SUMO-1基因mRNA表达水平的差异。结果 SUMO-1基因mRNA在胆囊癌及癌旁胆囊组织中都有表达,但在胆囊肝癌中的表达水平显著高于癌旁胆囊组织;在不同CA19-9水平的胆囊癌患者中SUM0-1基因mRNA均高表达,差别没有显著性;在胆囊腺瘤样息肉中SUMO-1基因mRNA也有表达,但表达水平明显低于胆囊癌。结论在不同CA19-9水平的胆囊癌中,SUMO-1基因mRNA均明显高表达,而在癌旁胆囊组织及胆囊腺瘤样息肉中表达较低,SUMO-1基因mRNA可作为诊断胆囊癌的一个重要的标志物。

胆囊癌组织中SUMO-1和EIF-5A2的表达及意义

目的探讨胆囊癌组织中SUMO-1、重组人真核翻译起始因子5A2(EIF-5A2)表达及意义。方法选取胆囊癌组织标本60例(胆囊癌组),同时选取因结石切除的胆囊组织标本30例为对照组,采用免疫组化染色法检测SUMO-1、EIF-5A2蛋白表达。结果胆囊癌组SUMO-1、EIF-5A2蛋白阳性表达率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);Nevein分期≥Ⅲ期患者SUMO-1、EIF-5A2蛋白阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05);有淋巴结转移患者EIF-5A2蛋白阳性表达率明显高于无淋巴结转移患者(P<0.05);胆囊癌组织中SUMO-1和EIF-5A2蛋白表达无相关性(rs=-0.117,P>0.05)。结论胆囊癌组织中SUMO-1、EIF-5A2表达明显升高,与胆囊癌Nevein分期、淋巴结转移有一定关系,在疾病发生发展中可能有重要作用。

SUMO-1基因在胆囊癌中的表达及意义

目的研究胆囊细胞株、胆囊癌标本及胆囊腺瘤样息肉组织中SUMO-1基因的表达及意义。方法采用RT-PCR、Western blot方法在mRNA及蛋白水平检测胆囊细胞株、胆囊癌标本及胆囊腺瘤样息肉组织中SUMO-1基因的表达。结果在mRNA及蛋白水平,SUMO-1基因在胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996、NOZ及胆囊癌标本中均明显高表达,而胆囊腺瘤样息肉组织中SUMO-1基因表达明显低,胆囊癌组织和胆囊腺瘤样息肉组织中SUMO-1表达有明显的差异(P<0.001)。结论 SUMO-1基因在胆囊癌中高表达,SUMO-1可能为胆囊癌诊断和治疗中的一个潜在的靶点。