青蒿对鼻咽癌细胞CNE-1、SUNE-1生长的影响

目的研究青蒿对鼻咽癌细胞系CNE-1、SUNE-1的生长抑制作用。方法①采用血清药理学的方法提取中草药青蒿的含药血清;②采用MTT法检测青蒿对CNE-1、SUNE-1细胞生长的抑制作用。结果 MTT法证实青蒿含药血清对鼻咽癌细胞CNE-1、SUNE-1细胞生长均有抑制作用;在SUNE-1细胞中无剂量-效应关系和时间效应关系;在CNE-1细胞中有剂量-效应依赖关系,无时间-效应依赖关系;结论青蒿含药血清对SUNE-1、CNE-1细胞的生长有抑制作用。

鼻咽癌细胞株SUNE-1异质性研究

目的：对鼻咽癌细胞株ＳＵＮＥ１异质性进行研究；方法：应用软琼脂集落形成实验、动物实验及ＲＮＡ指纹图谱差异显示对ＳＵＮＥ１４亚株５８Ｆ，９４Ｅ，６１０Ｂ，１３９Ｂ进行体外转化能力、成瘤性、转移能力及基因表达差异进行研究。结果：①４亚株体外转化能力、成瘤性和转移能力存在差异；②筛选出高成瘤、高转移潜能的亚株５８Ｆ、９４Ｅ，只成瘤不转移的６１０Ｂ，不成瘤的１３９Ｂ；③４亚株的基因表达存在异质性，并筛选出３条迁泳率不一致的差异片段。结论：ＳＵＮＥ１４亚株为起源于同一母系的不同的单克隆细胞亚株；为筛选和克隆ＮＰＣ发生发展相关基因的研究提供实验材料，亦为ＮＰＣ的基因治疗、免疫治疗及化学治疗的研究提供实验依据。

转移抑素抑制人鼻咽癌高转移能力细胞株SUNE-1-5-8F转移侵袭能力的研究

目的研究并探讨转移抑素(metastin)对人鼻咽癌高转移能力细胞株SUNE-1-5-8F转移侵袭能力的影响。方法 (1)采用Transwell体外侵袭趋化实验技术,在不同浓度(10~2nM、10~3nM、10~4nM)转移抑素干预前后计数转移及侵袭细胞数,探究其对SUNE-1-5-8F细胞转移能力和侵袭能力的影响。(2)采用BALB/c-nu裸鼠肺转移模型,40只裸鼠随机平均分为转移抑素组及对照组,2组均右侧腋窝下注射2×10~6/ml SUNE-1-5-8F细胞悬液,其中转移抑素组于第2天按1.17 mg/kg腹腔注射转移抑素,研究其对裸鼠移植瘤的抑瘤率、转移抑制率和生命延长率的影响;采用免疫组化法研究肺转移灶kisspeptin指标表达情况。结果 (1)Transwell实验中转移抑素对于SUNE-1-5-8F细胞的转移能力及侵袭能力均具有抑制作用(P<0.05),且其抑制能力与转移抑素浓度呈正相关(P<0.05)。(2)裸鼠实验中转移抑素对抑瘤率无明显影响(P>0.05),但可以降低肺转移数,提升转移抑制率(P<0.05),且进一步提高了小鼠的生命延长率(P<0.05)。免疫组化示转移抑素组kisspeptin较对照组高表达。结论 (1)Transwel实验中转移抑素能够抑制人鼻咽癌高转移能力细胞株SUNE-1-5-8F的转移侵袭能力,且转移抑素浓度与其抑制能力呈正相关。(2)裸鼠实验中转移抑素能够降低肺转移率,延长裸鼠生命,但与腋下移植瘤的增殖无显著相关性。

鼻咽癌细胞株、瘤株中EBV-LMP1基因的检测及变异性分析

采用ＰＣＲ法检测了不同代次的鼻咽癌细胞株、瘤株（ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ）中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因片断，并分析其变异性。结果发现直到１３１代ＳＵＮＥ、３０代ＳＵＮＴ中仍然能检测到ＬＭＰ１基因片断，且在传代过程中ＬＭＰ１基因未发生变异。但与Ｂ９５－８中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因相比，ＬＭＰ１基因发生了变异，表现为Ｘｈｏｌ、Ｍｓｐ酶切位点的消失和ＳＳＣＰ单链迁移率的不同。该结果提示变异的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因可能与ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ肿瘤的特性有一定的相关性。

AMIGO2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进鼻咽癌细胞的增殖

目的:探讨Ig样结构域2黏附分子(adhesion molecule with Ig like domain 2,AMIGO2)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞增殖中的作用及其机制。方法:选用2017年9月至11月福建省肿瘤医院收集的10例NPC组织和10例正常鼻咽黏膜上皮组织标本,以及NPC细胞系CNE-1、CNE-2、SUNE-1、6-10B、C666-1和人永生化鼻咽黏膜上皮细胞株NP69,用qPCR法检测NPC组织和细胞中AMIGO2 mRNA的表达。构建慢病毒载体干扰AMIGO2表达,用qPCR法验证其干扰效率;用CCK-8法、克隆形成及流式细胞术检测干扰AMIGO2表达对NPC细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响,用Western blotting检测干扰AMIGO2表达对NPC细胞增殖及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关标志蛋白表达的影响。结果:AMIGO2在NPC组织和CNE-2和SUNE-1细胞中高表达(均P<0.01)。慢病毒AMIGO2感染后,CNE-2和SUNE-1细胞的AMIGO2干扰效率均达50%以上。干扰AMIGO2表达,显著降低CNE-2和SUNE-1细胞增殖及克隆形成能力(均P<0.01)、明显提高细胞的凋亡率(均P<0.01);降低SUNE-1细胞中PI3K、AKT和mTOR磷酸化蛋白的表达水平(均P<0.01)、下调survivin和PCNA蛋白的表达水平(均P<0.01)。结论:AMIGO2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进NPC细胞增殖并抑制其凋亡,提示AMIGO2可能是NPC治疗的潜在靶点。

连翘苷对体内外鼻咽癌血管新生的影响

【目的】观察连翘苷抗鼻咽癌效应及机制。【方法】(1)体外实验:不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L)连翘苷作用于体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人鼻咽正常上皮细胞系NP69和鼻咽癌细胞系HNE1和SUNE-1后,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力,小管形成实验测定HUVECs血管新生活性,Transwell小室实验测定HUVECs侵袭活性,Western Blot法测定HNE1和SUNE-1细胞、HUVECs中血管内皮生长因子A(VEGFA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wnt和β-catenin表达水平。(2)体内实验:以连翘苷(10 mg/kg)对鼻咽癌异种移植瘤裸鼠进行干预后,采用血管造影法检测裸鼠鼻咽癌异种移植瘤的血管密度,免疫组织化学法检测鼻咽癌异种移植瘤中CD34、VEGFA和Wnt的表达。【结果】(1)连翘苷(0.625~10μmol/L)对体外HNE1和SUNE-1细胞活力有显著抑制效果,但对体外HUVECs和NP69的细胞活力无显著抑制效果;连翘苷(0.625~10μmol/L)可明显抑制HUVECs血管新生和侵袭活性,VEGFA(20μg/L)可削弱连翘苷对体外HUVECs血管新生和侵袭活性的抑制作用;连翘苷可下调VEGFA、Wnt和β-catenin在HNE1和SUNE-1细胞中的含量;连翘苷可诱导HUVECs中VEGFR2表达下调。(2)连翘苷(10 mg/kg)对裸鼠无明显毒副作用,但可显著抑制鼻咽癌异种移植瘤生长和血管新生,抑制鼻咽癌异种移植瘤组织中的CD34、VEGFA和Wnt的阳性表达。【结论】连翘苷对体内外鼻咽癌血管新生有显著抑制作用,其主要作用机制可能与调控Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2信号通路有关。

X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析及其致DNA双链断裂的动态变化

目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs^＋/＋）和DNA-PKcs^-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化。方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γH2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γH2AX焦点形成数量的差异。结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs^-/-和DNA-PKcs^＋/＋ MEF细胞中分别表达缺失和正常。应用γH2AX焦点/细胞和γH2AX焦点/mm2分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs^＋/＋、DNA-PKcs^-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后 0.5~1.0 h大量γH2AX焦点形成,DNA-PKcs^＋/＋ MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs^-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复。γH2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γH2AX焦点/mm2的峰值则出现在照后0.5 h。对于DNA-PKcs^＋/＋和DNA-PKcs^-/-MEF细胞,γH2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γH2AX焦点/mm2在照后3.0、6.0、12.0 h不同。结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γH2AX焦点/细胞或γH2AX焦点/mm2的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路。