带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建(英文)

目的 构建带有SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体。方法 采用体外重组技术构建带SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,酶切、测序进行鉴定 ,脂质体介导转染PA317包装细胞 ,经G4 18筛选出抗性克隆 ,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV4 0LT抗原基因 ,且为正向插入。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1.3× 10 6CFU/ml。结论 成功构建了含SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒。

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法 利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果 ( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论 成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 。

SV_(40)LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源

目的制备并初步评估一种理想的肝细胞来源—SV40LT抗原基因永生化肝细胞。方法将SV40LT抗原基因在逆转录病毒介导下转入原代培养的大鼠肝细胞,获得能在体外增殖的肝细胞。通过绘制生长曲线了解转染肝细胞的体外生长特性,细胞冻存复苏试验评估转染肝细胞的冻存价值并与原代肝细胞和大鼠肝癌细胞CBRH7919比较。结果SV40LT抗原基因转入原代培养的大鼠肝细胞能在体外增殖。SV40LT抗原基因转染肝细胞比原代肝细胞生长速度快(P<0.05),与肿瘤细胞相比生长曲线差异无显著性(P>0.05)。复苏后冻存的SV40LT抗原转染的肝细胞的细胞活率为(74±4)%,原代肝细胞的细胞活率为(72±6)%。两者差异无显著性(P>0.05)。结论肝细胞经SV40LT抗原基因转染后获得永生化特性,冻存复苏后获得满意的细胞活率,是一种理想的肝细胞来源。

SV40 T抗原与人U_1和U_2 snRNA基因的特异结合

利用DNA结合免疫分析证明,编码人U_1和U_2 snRNA基因的5′端区域含有与SV40 T抗原特异结合的序列。SV40 T抗原与U_2基因的亲和力大于U_1基因。DNasel足印(footprinting)分析取得与DNA结合免疫分析一致的结果。U_1和U_2基因的5′端区域含有能被T抗原所保护的,免于DNasel降解的序列。这两个基因的两条链上都含有约30bp长的DNA被T抗原所保护。U_1基因被保护的区域在-11bp—-42bp之间,而U_2基因被保护区域是在-58bp—-90bp之间。

十全大补汤对SV40 T抗原转基因小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用及其分子机制

目的:探讨十全大补汤对SV40T抗原转基因(TG)小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用,阐明其抑癌的分子机制。方法:SV40T抗原TG小鼠随机分为对照组(n=39)和药物处理组(n=25),对照组小鼠正常喂食,药物处理组小鼠出生3周后开始喂食添加十全大补汤的饲料,记录每只小鼠生存时间。在喂食十全大补汤8周和15周时,随机抽取各组小鼠(n=3)尾静脉血,检测血清氨基酸水平。取血后小鼠麻醉致死并取出肝脏,利用基因芯片杂交检测小鼠肝脏组织中与核糖体功能相关的基因表达差异。结果:生存分析,与对照组比较,药物处理组TG小鼠生存率明显升高(P<0.05)。氨基酸检测,与对照组比较,喂食十全大补汤8周时,药物处理组TG小鼠血清中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和羟赖氨酸水平升高(P<0.05),胱硫醚、牛磺酸、甲基组氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低(P<0.05);15周时,与对照组比较,药物处理组TG小鼠血清中苏氨酸和瓜氨酸水平升高(P<0.05),其他氨基酸水平无明显变化(P>0.05)。基因芯片杂交检测,与对照组比较,药物处理组TG小鼠肝组织表达的9 083个基因中与核糖体功能相关的13个基因发生改变(P<0.05)。结论:十全大补汤能改善TG小鼠血清氨基酸水平,增强肝脏核糖体蛋白合成,通过改善肝脏功能明显延长TG小鼠生存期。

纯合子胃壁细胞特异性表达SV40T抗原转基因小鼠品系的建立

目的:建立稳定遗传的纯合子SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠品系。方法:通过定量PCR法比较已知杂合子小鼠和未知阳性小鼠中外源基因的起始模板量来确定小鼠的基因型,并通过测交的方法来验证试验结果。结果:用定量PCR法选育出15只纯合子小鼠,经测交验证它们与野生型小鼠交配所生的后代均为阳性,证明了定量PCR的结果是正确的。通过纯合子之间的全同胞交配建立了6个独立的纯合子品系。结论:定量PCR具有省时、省力及高通量等优点,能够很好地应用于筛选纯合子转基因动物。

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型。方法从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H+-K+ATPaseβpromoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况。结果将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%。在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠。除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠。8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76)。RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达。不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在。结论建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型。

SV40T抗原胃壁细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T抗原的真核表达裁体并进行鉴定.方法:采用酚-氯仿法从昆明小鼠肝细胞中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增H^+/K^+ATPaseβ亚基启动子,产物命名为HK.将PCR产物纯化回收后与pMT18-T载体相连,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含SV40T基因片段的质粒p LITAg中酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,并测序鉴定.结果:pcDNA3.1(-)/HKSV用XbaⅠ、BarnHⅠ双酶切可得到1kb H^+/K^+ATPaseβ亚基启动子,2.7 kb SV40T基因与5.4 kb pcDNA3.1(-)载体3条DNA条带.用XbaⅠ、KpnⅠ双酶切电泳,可见到约3.7与5.4 kb的两条DNA条带;用BamHⅠ单酶切电泳,可见到2.7与6.4 kb的2条DNA条带;用EcoRⅠ单酶切,只见到约9.1 kb的1条DNA条带,酶切电泳结果均与设计一致.测序结果显示,H^+/K^+ATPaseβ亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中.结论:构建在胃壁细胞中特异性表达SV40T基因的真核表达载体,为进一步转基因小鼠及胃癌动物模型的建立提供了稳定、可靠的分子工具.

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的 :研究SV4 0大T抗原 (LT)基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用 ,以及转化后细胞生物学特性的改变 .方法 :采用脂质体介导的方法 ,利用含有LTcDNA的质粒psv3 neo转染人正常皮肤成纤维细胞 .G4 18筛选后 ,挑选阳性克隆扩大培养 ,观察基因及蛋白在细胞内的表达 ,以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况 .结果 :分离获得转化细胞克隆 ,原位杂交显示LTmRNA在转染细胞胞质中表达 .免疫组化结果显示 ,细胞质中有SV4 0大T抗原表达 .细胞计数、Br dU、流式细胞仪检测表明 ,经过一段时间的旺盛生长 ,在转染后第 16代 ,细胞即进入危机期 ,以一种比衰老细胞更快的速度死亡 .结论 :LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖 ,但这种能力是有限的 ,在转染后期甚至会促进细胞死亡 .所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化 ,单纯利用LT的转染是不够的 。

SV40T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的 建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系。方法 根据已发表的SV4 0病毒T基因序列设计引物 ,以整合有SV4 0DNA早期基因区的COS 1细胞基因组DNA为模板 ,用高保真PCR扩增SV4 0T基因。将获得的SV4 0T基因克隆入真核表达载体 ,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞。经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆 ,对其生物学特性进行研究。结果 扩增出序列正确的SV4 0T基因 ,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第 4天 ,细胞群体倍增时间为 2 3 5h ,克隆形成率为2 6 7%。DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV4 0T基因 ,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常 ,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤 ,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长。部分细胞克隆已在体外传 30代以上 ,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征 ,在胶原基质上能形成腺泡样结构。结论 本研究获得的SV4 0T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性。

SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达

目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达。结果SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段。结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

SV40 LT基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用猿猴病毒40大T抗原(SV40 LT)基因异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(hM-SCs)系。方法使用含有SV40大T片段的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。该系已培养5个月,超过36代。细胞免疫组化染色显示有SV40 LT的表达。结论成功地构建了SV40 LT基因永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。

两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立

目的 为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法 利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果 利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论 本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。

人脑肿瘤中SV40大T抗原与pRb形成特异性复合物

目的：探讨 Ｓ Ｖ４０ 早期基因编码产物大 Ｔ 抗原（ Ｔａｇ） 表达及与抑癌蛋白ｐ Ｒｂ 的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义。方法：采用免疫共沉淀及 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹法检测４３ 例人脑肿瘤组织及５ 例正常人脑组织中 Ｔａｇ 的表达，并对１５ 例 Ｔａｇ 阳性瘤组织检测 Ｔａｇ － ｐ Ｒｂ 复合物的存在。结果： Ｔａｇ 在５ 例室管膜瘤及２ 例脉络丛乳头状瘤中全部表达，垂体腺瘤（５／６） 、星形胶质细胞瘤（７／１０） 、脑膜瘤（４／６） 、多形性胶质母细胞瘤（２／５） 及髓母细胞瘤（１／５） 均有 Ｔａｇ 的表达； ３ 例少枝胶质细胞瘤、１ 例松果体瘤及５ 例正常人脑组织无 Ｔａｇ 表达。１５ 例 Ｔａｇ 阳性瘤组织中均发现 Ｔａｇ 与ｐ Ｒｂ 形成特异性复合物。结论：在人脑肿瘤组织中 Ｔａｇ 广泛表达， Ｔａｇ 可与ｐ Ｒｂ 形成特异性复合物， Ｔａｇｐ Ｒｂ特异性复合物的形成导致ｐ Ｒｂ 失活，可能是人脑肿瘤发生发展的一个重要机理。

SV40T/LoxP等外源性基因修饰与肝细胞永生化的研究

目的构建永生化肝细胞系,观察其生长状态及检测其相关生物免疫学特性。方法拟利用基因重组克隆方法构建含有SV40T、EGFP基因片段以及LoxP序列,插入Cre基因片段,采用脂质体转染法将新载体pSV-GFP-Cre-LOX转染至来源于成人原代供肝细胞,建立新型肝细胞体系进行细胞培养;利用转化肝细胞能够表达绿色荧光蛋白特性观察该体系中转化肝细胞的生长状况,最后通过系列生化免疫反应检验转化肝细胞的生化免疫学特性;通过Cre重组酶定点切割导入的SV40T基因使转化肝细胞回复到永生化前的状态,并检测其细胞学相关特性。结果转染SV40T基因的肝细胞具备正常肝细胞生物学特性,且增殖较快,体外易培养。结论新建永生化肝细胞系可以为进一步肝细胞移植提供理想细胞材料作出研究基础。

猕猴肉瘤病毒SV40 T-ag-C基因克隆及序列分析

目的对来源于一株自然感染猕猴肉瘤病毒SV40的猴肾细胞培养物进行大T抗原C-羧基端(T-ag-C)基因克隆及核苷酸序列分析。方法采用PCR法分别从一株自然感染SV40病毒的猴肾细胞培养物和SV40776标准株接种的vero细胞培养物提取的总DNA中扩增出441bp的SV40大T抗原C-羧基端(T-ag-C)基因片段,分别将其克隆到PMD18-T载体中,转化至JM109感受态大肠杆菌细胞后,挑取阳性克隆进行测序鉴定,并对获得的目的基因核苷酸序列进行序列分析及同源性分析。结果来源于猴肾细胞培养物的SV40大T抗原片段与本实验室来源于云南野生猴群的猕猴外周血所得到的SV40大T抗原片段同源性为97.31%,与GenBank中登录号为NC_001669.1序列进行比对,同源性为96.33%;与SV40-776标准株接种的vero细胞培养物所扩增的大T抗原片段同源性为97.55%。结论对大T抗原基因克隆和序列分析是了解和掌握SV40病毒分子流行病学及其变异趋势的重要手段。

重组SV40大T抗原慢病毒表达载体的构建

目的构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,转染真核细胞Eca-9706并检测SV40大T抗原基因在真核细胞内的表达。方法以PCR方法从含有SV40大T抗原基因的质粒上扩增出SV40大T抗原基因作为靶基因;将其连接至pGEM-TEasy载体上,并对靶基因进行DNA测序确认;再将靶基因与慢病毒表达载体pLentiGFP重组构建成为pLentiGFP-Tag;以脂质体介导转染真核细胞Eca-9706,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基因在细胞内的表达,使用RT-PCR检测SV40大T抗原基因在细胞内的表达水平。结果成功克隆SV40大T抗原基因,经由DNA测序确认;成功筛选出含SV40大T抗原基因正插子的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag;转染真核细胞Eca-9706后48 h,观察到绿色荧光的广泛表达并检测出宿主细胞内高效表达的SV40大T抗原mRNA。结论成功构建含SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,并观察到SV40大T抗原在真核细胞中的成功表达。

人脑胶质组织中SV40大T抗原表达及p53形成特异性复合物

目的 探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原 (Tag)表达及与抑癌蛋白p5 3的相互作用在人脑胶质瘤发生发展中的意义。方法 采用免疫组织化学方法检测 89例人脑胶质瘤组织和 11例正常人脑组织中Tag的表达 ,并对Tag表达阳性瘤组织进行免疫共沉淀和Westernblot检测Tag p5 3复合物的存在。结果 89例人脑胶质瘤组织Tag表达阳性 33例 (阳性率 37 1% ) ,Tag表达水平与胶质瘤病理分级呈显著正相关 (pearson列联系数 =0 72 ,P <0 0 1) ;33例Tag表达阳性瘤组织中均发现Tag与p5 3形成特异性复合物。 11例正常人脑组织Tag表达全部阴性。结论 SV40感染与人脑胶质瘤病因学密切相关 ,Tag可能是SV40在胶质瘤发生发展中起作用的重要因素 ;Tag与p5 3可形成特异性复合物 ,Tag p5 3特异性复合物的形成导致p5 3失活 ,可能是人脑胶质癌发生发展的一个重要机理。

不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平测定

目的:检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法:取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果:B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平(μg/L)分别为(2.814±0.209)、(1.135±0.114)、(0.853±0.701)、(2.371±0.335)、(1.371±0.190)、(0.685±0.374)、(2.274±0.251)、(2.471±0.251)和(0.986±0.173),9组相比,差异有统计学意义(F=17.449,P<0.001);其中2#、4#、24#、51#及73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平较B6小鼠明显降低(P<0.05)。结论:筛选出了5个稳定表达的SV40T转基因小鼠品系。