SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒(AdHu5-SV40LT)转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒(AdHu5-SV40LT)。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建(英文)

目的 构建带有SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体。方法 采用体外重组技术构建带SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,酶切、测序进行鉴定 ,脂质体介导转染PA317包装细胞 ,经G4 18筛选出抗性克隆 ,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV4 0LT抗原基因 ,且为正向插入。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1.3× 10 6CFU/ml。结论 成功构建了含SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒。

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法 利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果 ( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论 成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 。

SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的构建SV40LT基因过表达慢病毒载体,并对其进行慢病毒包装,为建立永生化的uncv小鼠胚胎成纤维细胞奠定基础。方法从293T细胞中获得SV40LT基因,将其克隆到p Lenti-GFP质粒中,构建重组穿梭质粒p Lenti-GFP-SV40LT,测序鉴定后分别将鉴定的阳性p Lenti-GFP-SV40LT和包装质粒p MD2.0G和ps PAX2共转染293T细胞,包装产生慢病毒。结果 SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装成功。结论 SV40LT基因过表达慢病毒载体构建与包装的成功为uncv小鼠胚胎成纤维细胞的永生化提供了工具。

慢病毒载体介导SV40LT致人脐静脉内皮细胞永生化

为成功分离与鉴定人原代脐静脉内皮细胞,用猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系。将含SV40LT cDNA片段的慢病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养。通过形态、细胞免疫组织化学、RT-PCR及管状成形试验进行原代及转染后细胞形态学和功能学鉴定及检测SV40大T抗原表达。结果SV40LT转染后的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形或短梭状,呈单层铺路石状镶嵌排列。特异性表达Ⅷ因子、KDR、SV40LT表达,并具有管状成型能力。说明成功分离与鉴定永生化的脐静脉内皮细胞系,为后续血管靶向治疗奠定了基础。

SV40LT抗原诱导人源性淋巴细胞恶性转化

目的:研究SV40 Large T(LT)对淋巴细胞转化的影响。方法:将逆转录病毒载体质粒pBabe-SV40LT转入外周血单核细胞。倒置显微镜观察细胞形态变化,蛋白印迹明确LT蛋白表达,流式细胞仪分析膜表面分子的表达,G显代染色体确定核型,生长曲线判别细胞生长状态。软琼脂实验检测细胞恶性变。结果:导入SV40LT后的淋巴细胞形态发生明显改变,由悬浮生长变为贴壁生长。转染细胞中可以检测到LT抗原的表达,有67%细胞表达CD56+分子,核型为异倍体,可在软琼脂上形成细胞集落。结论:用SV40LT转染获得一株可稳定传代且具有CD56+的异倍体恶性淋巴细胞。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 建立人源性肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 利用SV4 0LTag基因和真核表达载体pcDNA3.1( - )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 经G4 1870 0～30 0 μg/ml筛选 ,4 2d后获一抗G4 18肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌白蛋白 (ALB)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)及乳酸脱氢酶 (LDH)的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经逆转录聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹检测 ,转染肝细胞的ALBmRNA阳性和细胞色素P4 5 0 2E1阳性。

温度调控tsSV40LT抗原转基因干细胞的增殖与分化

脑创伤（TBI）位点及其边缘的半损伤带处于明显的缺血缺氧状态。我们的前期工作证实亚低温治疗可有效改善TBI脑血流、降低脑组织代谢率、减轻局部毒素堆积程度。我们利用温度敏感性猿猴病毒40大T抗原（tsSV40LT）建立一种温度敏感型干细胞株，观察其增殖和分化特征。

梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。

SV_(40)LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源

目的制备并初步评估一种理想的肝细胞来源—SV40LT抗原基因永生化肝细胞。方法将SV40LT抗原基因在逆转录病毒介导下转入原代培养的大鼠肝细胞,获得能在体外增殖的肝细胞。通过绘制生长曲线了解转染肝细胞的体外生长特性,细胞冻存复苏试验评估转染肝细胞的冻存价值并与原代肝细胞和大鼠肝癌细胞CBRH7919比较。结果SV40LT抗原基因转入原代培养的大鼠肝细胞能在体外增殖。SV40LT抗原基因转染肝细胞比原代肝细胞生长速度快(P<0.05),与肿瘤细胞相比生长曲线差异无显著性(P>0.05)。复苏后冻存的SV40LT抗原转染的肝细胞的细胞活率为(74±4)%,原代肝细胞的细胞活率为(72±6)%。两者差异无显著性(P>0.05)。结论肝细胞经SV40LT抗原基因转染后获得永生化特性,冻存复苏后获得满意的细胞活率,是一种理想的肝细胞来源。

大鼠脾内肝细胞移植的早期组织形态学和超微结构的实验研究

目的研究脾内移植的SV40LT抗原基因肝细胞的早期组织形态学和超微结构特点并初步探讨其机制。方法Wistar大鼠随机分组后脾脏内移植原代肝细胞(A,B组)或SV40LT抗原基因肝细胞(C,D组)。静脉给予(B,D组)或不给予(A,C组)环胞霉素A。移植后1～14d对受体脾脏内肝细胞的组织形态及超微结构进行观察和分析。结果静脉给予环胞霉素A的B,D组,与不给予环胞霉素A的A,C组比较,移植肝细胞的组织形态学及超微结构改变明显较小,移植肝细胞的存活数显著增高(P<0.05)。使用环胞霉素A的D组与B组之间移植细胞的存活率在1～7d差异没有显著性(P>0.05),而8～14dD组与B组相比,D组细胞存活率较高(P<0.01)。结论SV40LT抗原基因肝细胞脾脏内移植后,在使用免疫抑制剂的情况下能长时间保持较高的存活细胞数,维持完整的组织形态学结构。

哺乳动物睾丸细胞株的建立及应用

哺乳动物生精过程是一个精细的调节过程 ,人们对于这个过程还了解甚少。这主要是由于维持生殖细胞体外培养的必需条件尚未建立 ,睾丸生精细胞可原代培养的时间太短。因此 ,有必要建立能在体外长期传代的睾丸生精细胞株。Hofmann等人用磷酸钙法将猴病毒 40大T抗原 (sv40lt)基因掺入小鼠睾丸细胞建立了永生的睾丸细胞株 ,并利用这些细胞株研究了睾丸特异基因的表达。随后 ,又通过对小鼠睾丸生精细胞共转染sv40lt基因和编码温度敏感p5 3蛋白基因 ,建立了两个能在体外继续分化的生精细胞株。这些睾丸细胞株的建立为精子发生研究提供了一个有用的实验模型。

LSL-Cas9小鼠永生化胚胎成纤维细胞系的构建及应用

目的:利用猿猴病毒40(Simian virus 40,SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高效验证。克服由于Cas9序列过大而引起的转染效率低的问题,构建一种用于sgRNA剪切效率验证的经济、便捷、高效工具。方法:以LSL-Cas9胎鼠为实验动物,分离其MEF并感染SV40 LT慢病毒;利用潮霉素筛选成功转化的细胞;通过免疫荧光检测成纤维细胞标志物表达和细胞衰老情况,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定SV40 LT抗原基因在MEF中的整合情况,建立永生化无限增殖细胞系;以IL10Rα基因为例验证该系统的可行性:设计4种sgRNA,利用含有PU6-sgRNA串联PCSP-Cre基因表达盒的质粒转化永生化LSL-Cas9小鼠MEF系;通过T7内切核酸酶I(T7 endonuclease I,T7EI)法评估sgRNA的剪切效率,挑选靶向性最优的sgRNA。结果:经潮霉素筛选的阳性细胞扩大培养并稳定传代至60代,具备永生化无限增殖细胞系的特点;经PCR鉴定,SV40 LT抗原基因已稳定整合至MEF基因组中;T7EI酶切法证实sgRNA有效引导Cas9内切核酸酶实现了靶基因的切割,4种sgRNA的基因编辑效率分别为28.17%、45.87%、33.61%、38.62%。结论:SV40 LT抗原基因介导的永生化无限增殖LSL-Cas9 MEF系构建成功,可实现sgRNA引导Cas9剪切效率的高效快速验证。

GPS2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化及其增殖凋亡的检测

目的利用SV40大T抗原(SV40LT)过表达慢病毒建立永生化的GPS2野生与敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系,并检测GPS2敲除对MEF增殖及凋亡的影响。方法构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,并进行病毒包装。分离胚胎发育9.5 d(E9.5d)的MEF细胞,感染SV40LT慢病毒,连续传代培养50代以上,把仍存活且状态良好的GFP阳性细胞视作永生化成功的MEF细胞。利用高内涵细胞成像分析仪检测永生化MEF细胞的增殖情况,采用AnnexinⅤ/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,获得滴度为4.03×108pfu/ml的病毒。分离E9.5d MEF细胞并感染上述病毒,阳性细胞扩大培养并稳定传代50代以上,成功建立了永生化的MEF细胞系。GPS2敲除MEF细胞的增殖能力明显低于野生型,而二者由于血清撤除所引起的凋亡并无明显差异。结论敲除GPS2抑制MEF细胞的增殖。