SV40T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

目的 建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系。方法 根据已发表的SV4 0病毒T基因序列设计引物 ,以整合有SV4 0DNA早期基因区的COS 1细胞基因组DNA为模板 ,用高保真PCR扩增SV4 0T基因。将获得的SV4 0T基因克隆入真核表达载体 ,并用获得的重组表达质粒转染山羊原代乳腺上皮细胞。经有限稀释和反复传代后获得转化细胞克隆 ,对其生物学特性进行研究。结果 扩增出序列正确的SV4 0T基因 ,重组质粒转染获得的转化细胞的对数生长期为接种后第 4天 ,细胞群体倍增时间为 2 3 5h ,克隆形成率为2 6 7%。DNA斑点杂交试验证明转化细胞的基因组中整合有SV4 0T基因 ,染色体核型分析试验表明转化细胞的核型无明显异常 ,裸鼠接种试验证明转化细胞不能形成肿瘤 ,软琼脂集落形成试验表明转化细胞在软琼脂中不能生长。部分细胞克隆已在体外传 30代以上 ,保持正常乳腺上皮细胞的形态特征 ,在胶原基质上能形成腺泡样结构。结论 本研究获得的SV4 0T基因转化的山羊乳腺上皮细胞具有转化细胞系的生物学特性。

SV40T基因转染黑素细胞遗传稳定性研究

目的探讨SV40T抗原基因转染构建的永生化黑素细胞的遗传稳定性。方法体外培养黑素细胞,对第20代的永生化黑素细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞增殖情况,同时分析染色体核型,流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析第20代细胞hMLH1、hMSH2错配修复基因表达,并提取细胞基因组,微卫星位点PCR产物进行变性聚丙烯酰胺电泳分析微卫星不稳定性。结果经过连续培养的第20代转染的黑素细胞左旋多巴染色阳性,增殖速度较原代培养黑素细胞明显增快,细胞周期S+G2期细胞比例较原代黑素细胞增多,同时未见异常DNA倍体,染色体仍为2倍体,转染细胞的hMLH1、hMSH2错配修复基因表达较正常黑素细胞上调;在1p22(D1S187)、5q14(D5S107)、18q12.2-12.3(D18S34)3个位点未出现微卫星不稳定性(m icrosatellite instab ili-ty,M I)。结论SV40T抗原基因转染的黑素细胞体外培养不出现遗传稳定性的异常改变。

两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立

目的 为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法 利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果 利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论 本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。

SV40 T基因诱导的人卵巢癌细胞永生化

目的 建立人卵巢癌永生化细胞系 ,为卵巢癌体外研究提供实验模型。方法 利用基因重组技术构建猴肾病毒 4 0 (SV4 0 )T抗原基因的高效真核表达载体 pcD2 SV4 0。将其转染 10例原代培养的早期传代细胞 ,经G4 18筛选 ,抗性克隆扩大培养 ,建立永生化细胞系。免疫组化检测细胞的上皮起源 ,用PCR、RT PCR和SouthernBlot方法鉴定SV4 0T基因在转染细胞中的表达。观察所建立的永生化细胞系的染色体核型。结果 10例转染细胞中 ,6例筛选出抗性克隆。角蛋白免疫组化证实 3例为上皮起源。其中 2例上皮起源细胞得以扩大培养成系 ,长期稳定传代 ,分别命名为BUPH :OVSC 2和BUPH :OVCA 3。经鉴定两种细胞系中存在SV4 0T在基因水平及转录水平的表达。其染色体核型均符合人体恶性细胞特征。结论 利用SV4 0T抗原基因进行人卵巢癌原代细胞的永生化是一种可行的、可重复的建系方法 ,可提高卵巢癌细胞成系机率。

PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系,为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。方法:采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中,建立永生化细胞系;利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况,利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达。结果:SV40大T抗原基因已整合至MEF中,且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久。结论:成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系,可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。