SV40T外显子的拼接及逆转录病毒载体pLLTSN的构建

目的:为构建肝细胞永生化载体,对猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)外显子进行拼接并以其为外源片段构建逆转录病毒永生化载体pLLTSN. 方法:以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T的2个外显子,重叠延伸拼接法将两个外显子拼接到一起,然后用双粘端连接法将其克隆到空载体pLXSN 的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选,鉴定阳性克隆并经DNA测序验证. 结果:拼接成2.1 kb的SV40T,用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中4个为阳性,均含有2.1 kb SV40T插入片段.经质粒DNA测序分析的阳性克隆,确证无内含子. 结论:获得重组的2.1 kb无内含子的SV40T,成功构建了逆转录病毒载体pLLTSN.