SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定。用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况。结果限制性内切酶分析与测序结果示H+/K+ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性。认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础。

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定。方法:扩增小鼠H+/K+ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK;从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定。用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达。结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达。结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功。

SV40 T抗原与人U_1和U_2 snRNA基因的特异结合

利用DNA结合免疫分析证明,编码人U_1和U_2 snRNA基因的5′端区域含有与SV40 T抗原特异结合的序列。SV40 T抗原与U_2基因的亲和力大于U_1基因。DNasel足印(footprinting)分析取得与DNA结合免疫分析一致的结果。U_1和U_2基因的5′端区域含有能被T抗原所保护的,免于DNasel降解的序列。这两个基因的两条链上都含有约30bp长的DNA被T抗原所保护。U_1基因被保护的区域在-11bp—-42bp之间,而U_2基因被保护区域是在-58bp—-90bp之间。

十全大补汤对SV40 T抗原转基因小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用及其分子机制

目的:探讨十全大补汤对SV40T抗原转基因(TG)小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用,阐明其抑癌的分子机制。方法:SV40T抗原TG小鼠随机分为对照组(n=39)和药物处理组(n=25),对照组小鼠正常喂食,药物处理组小鼠出生3周后开始喂食添加十全大补汤的饲料,记录每只小鼠生存时间。在喂食十全大补汤8周和15周时,随机抽取各组小鼠(n=3)尾静脉血,检测血清氨基酸水平。取血后小鼠麻醉致死并取出肝脏,利用基因芯片杂交检测小鼠肝脏组织中与核糖体功能相关的基因表达差异。结果:生存分析,与对照组比较,药物处理组TG小鼠生存率明显升高(P<0.05)。氨基酸检测,与对照组比较,喂食十全大补汤8周时,药物处理组TG小鼠血清中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和羟赖氨酸水平升高(P<0.05),胱硫醚、牛磺酸、甲基组氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低(P<0.05);15周时,与对照组比较,药物处理组TG小鼠血清中苏氨酸和瓜氨酸水平升高(P<0.05),其他氨基酸水平无明显变化(P>0.05)。基因芯片杂交检测,与对照组比较,药物处理组TG小鼠肝组织表达的9 083个基因中与核糖体功能相关的13个基因发生改变(P<0.05)。结论:十全大补汤能改善TG小鼠血清氨基酸水平,增强肝脏核糖体蛋白合成,通过改善肝脏功能明显延长TG小鼠生存期。

重组SV40大T抗原慢病毒表达载体的构建

目的构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,转染真核细胞Eca-9706并检测SV40大T抗原基因在真核细胞内的表达。方法以PCR方法从含有SV40大T抗原基因的质粒上扩增出SV40大T抗原基因作为靶基因;将其连接至pGEM-TEasy载体上,并对靶基因进行DNA测序确认;再将靶基因与慢病毒表达载体pLentiGFP重组构建成为pLentiGFP-Tag;以脂质体介导转染真核细胞Eca-9706,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基因在细胞内的表达,使用RT-PCR检测SV40大T抗原基因在细胞内的表达水平。结果成功克隆SV40大T抗原基因,经由DNA测序确认;成功筛选出含SV40大T抗原基因正插子的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag;转染真核细胞Eca-9706后48 h,观察到绿色荧光的广泛表达并检测出宿主细胞内高效表达的SV40大T抗原mRNA。结论成功构建含SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP-Tag,并观察到SV40大T抗原在真核细胞中的成功表达。

几种小分子化合物对P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用的影响

以P5 3蛋白与SV4 0大T抗原之间的相互作用作为药物分子靶标 ,利用酵母双杂交系统的α -半乳糖苷酶活力的测定方法 ,测定了两个系列的化合物对于P5 3蛋白与SV4 0大T抗原相互作用的影响。其中一个系列包括ZnCl2 、MgCl2 、CaCl2 和Cu Cl2 、BaCl2 等二价金属盐 ;另一个系列是几种新疆特色植物的天然提取物 ,包括蒜氨酸、大蒜素、罗丹明B类物质AJ - 8、黄酮、苦参碱、去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱等。结果发现 ,ZnCl2 能够特异使P5 3蛋白与SV4 0大T抗原之间的相互作用增强 15 %左右 ,而大蒜素和黄酮能够降低这两个蛋白的相互作用 ,降低程度分别为 4 0 %和 30 % ,其它药物基本不影响两个蛋白的相互作用。

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型。方法从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H+-K+ATPaseβpromoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况。结果将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%。在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠。除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠。8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76)。RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达。不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在。结论建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型。

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

小鼠MEF/Hsf1^(-/-)/Hsf1细胞系的重建及Hsf1,SV40T-ag蛋白的表达

目的:重建热休克转录因子1(Heat shock transcription factor 1,Hsf1)过表达的MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系,为进一步研究Hsf1的功能提供实验模型。方法:将携带Hsf1全长基因的逆转录病毒载体pWZL-blast-flag-Hsf1,通过瞬时转染的方法,转染产生病毒的小鼠包装细胞293Phoenix。用病毒上清直接感染MEF/Hsf1-/-细胞,建立Hsf1稳定表达的MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系。通过Western blot实验,检测Hsf1和SV40T抗原(T-antigen,T-ag)蛋白的表达。结果:Hsf1蛋白在MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞中的表达比WT/MEF细胞强,而在MEF/Hsf1-/-细胞中没有明显表达。SV40T-ag蛋白在MEF/Hsf1-/-细胞中的表达明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞强,而SV40T-ag蛋白在WT/MEF细胞中的表达强于MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞。结论:成功建立了MEF/Hsf1-/-/Hsf1细胞系;Hsf1参与了对SV40T-ag蛋白的表达调控。

不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平测定

目的:检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法:取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果:B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平(μg/L)分别为(2.814±0.209)、(1.135±0.114)、(0.853±0.701)、(2.371±0.335)、(1.371±0.190)、(0.685±0.374)、(2.274±0.251)、(2.471±0.251)和(0.986±0.173),9组相比,差异有统计学意义(F=17.449,P<0.001);其中2#、4#、24#、51#及73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平较B6小鼠明显降低(P<0.05)。结论:筛选出了5个稳定表达的SV40T转基因小鼠品系。

脂质体介导SV40T基因构建东方田鼠成纤维细胞永生系技术体系的建立

为了优化脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的条件,提高其转染效率,试验采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠成纤维细胞中,经过G418培养基加压筛选、阳性细胞克隆的筛选及扩大培养、永生化细胞中SV40T基因的整合与表达检测、永生系细胞生长曲线测定等步骤,成功构建了东方田鼠成纤维细胞永生系。结果表明:采用SV40T基因单导入的方法,可成功构建东方田鼠成纤维细胞永生系。

SV40 LT基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用猿猴病毒40大T抗原(SV40 LT)基因异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(hM-SCs)系。方法使用含有SV40大T片段的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。该系已培养5个月,超过36代。细胞免疫组化染色显示有SV40 LT的表达。结论成功地构建了SV40 LT基因永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。

猴空泡病毒40大T抗原基因诱导人骨髓间充质干细胞的永生化

背景:细胞永生化是细胞获得持续增殖能力的一种特性,大T抗原基因可使细胞永生化效率提升,并广泛应用于实验中,越来越受到研究者的关注。目的:建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株,为人骨髓间充质干细胞的临床应用奠定基础。方法:使用含有猴空泡病毒40大T抗原基因的重组质粒载体转染人骨髓间充质干细胞,连续传代培养,通过形态学、细胞增殖能力、细胞表面标记、多向分化潜能等方法进行鉴定。结果与结论:①该方法构建的永生化细胞株为贴壁生长的梭形细胞,具有人骨髓间充质干细胞特异性表面标志;②转染后第50代人骨髓间充质干细胞仍然可表达猴空泡病毒40大T抗原基因;③永生化细胞株的增殖能力优于未转染人骨髓间充质干细胞;④永生化细胞株具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化的潜能;⑤由此可见,转染猴空泡病毒40大T抗原基因不影响人骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化能力,该方法可以用于建立人骨髓间充质干细胞永生化细胞株。

脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的研究

采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,经过G418培养基加压筛选,定期观测每孔阳性克隆出现的时间、数量及生长状态;比较不同胎龄或日龄、细胞接种密度、传代次数、脂质体剂量对脂质体介导的SV40T基因转染东方田鼠胚胎和皮肤两种成纤维细胞效率的影响。结果显示,两种细胞的阳性克隆约在15 d后出现,随着胎龄或鼠龄的增加,阳性细胞克隆在数量和增殖程度上有减少和减慢的趋势;以接种密度为1×104/孔的胚胎和皮肤成纤维细胞转染和筛选效果最好,细胞克隆增殖最快,数量最多;随着传代次数的增加,细胞克隆转染和筛选效果变差;在其他条件一致的情况下,以1 L/孔脂质体使用剂量,阳性克隆出现的时间早、克隆数量多、生长状态好。

端粒酶催化亚单位和猿猴病毒40大T抗原致人脐静脉内皮细胞永生化

目的 用端粒酶催化亚单位(hTERT)和猿猴病毒 40大T抗原(SV40大T)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系。方法 构建含有hTERT和SV40大TcDNA片段的逆转录病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养。通过细胞免疫组织化学观察、Westernblot分析hTERT和SV40大T抗原表达、PCR ELISA检测端粒酶活性、ELISA分析内皮特异性E 选择素和RT PCR测定内皮细胞脂肪酶进行细胞形态学和功能学鉴定。结果 转染的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形,呈单层铺路石状镶嵌排列。有Ⅷ因子、SV40大T、hTERT表达、E 选择素和内皮细胞脂肪酶表达阳性。转染细胞中端粒酶活性经测定在第 12代时为 0 36, 在第 50代时为 0 38, 而对照的原代细胞在第 1代时为 1 12,第 3代时仅为 0 06。结论 导入外源性端粒酶催化亚单位和SV40大T抗原能使人脐静脉内皮细胞永生化,保持内皮细胞性状不改变。

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。方法运用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆并扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合,RT-PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线。结果阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代,经鉴定SV40T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达。结论成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系。

东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化M fSF系。实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到M fSF中并稳定表达。本研究利用SV40T基因导入制备了永生化M fSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系。

肝细胞永生化策略研究进展

正常体细胞在细胞分裂过程中由于无法维持端粒的长度和染色体的稳定而衰老、死亡。建立基因稳定、无致瘤性的永生化细胞是永生化研究的目的所在。利用Cre-loxP系统构建的可恢复性永生化细胞可用于以细胞为基础的临床治疗。分化良好并具有肝脏正常合成代谢功能的永生化肝细胞在生物医学研究,尤其是在肝细胞移植、生物人工肝支持治疗以及药理学和毒理学研究方面具有广泛的应用前景。

正常大肠干细胞的条件永生化

目的 :建立正常人大肠干细胞系。方法 :用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞 ,以含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒感染 ,对其进行永生化 ;然后 ,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定。结果 :用中性蛋白酶分级消化获得的 AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形。该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒后 8～ 12周出现上皮样细胞克隆 ,经细胞特性鉴定 :PAS染色黏蛋白阳性 ,上皮细胞角蛋白 pan、CK- 8、CK- 19均阳性 ;用 EL ISA- PCR法检测该细胞第 12代和第 4 3代端粒酶活性 ,分别为 0 .4 3、0 .83;用 Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和 SV4 0大 T抗原 ;用 RT- PCR检测示该细胞株表达 Musashi- 1m RNA;以 1× 10 6细胞数接种裸鼠 ,观察 4个月无肿瘤形成 ,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现。结论 :建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征 ,可作为体外研究致癌剂

PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系,为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。方法:采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中,建立永生化细胞系;利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况,利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达。结果:SV40大T抗原基因已整合至MEF中,且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久。结论:成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系,可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料。