新型铂(Ⅱ)类配合物对结肠癌SW620细胞系的体外抗癌活性研究

目的:本实验研究了两种新型铂(Ⅱ)类配合物(2,3-吡啶二羧酸二水合铂、2,3-吡嗪二羧酸二水合铂)对结肠癌SW620细胞系的体外抗癌活性及其对细胞凋亡的影响。同时与奥沙利铂作一对照,以明确该两种新型铂(Ⅱ)类配合物是否具有更好的体外抑瘤效果。方法:采用人结肠癌细胞系SW620作为研究对象,三种药物分别以不同浓度作用于对数生长期的SW620细胞24h、48h后,应用软琼脂糖集落形成试验检测集落形成抑制率,以Annexinv/PI双染法测定细胞凋亡率,以扫描电镜观测三种药物作用后细胞形态和超微结构的改变。结果:软琼脂糖细胞集落形成抑制率实验显示出奥沙利铂、吡嗪、吡啶三种药物做用24h后对SW620细胞系的半数抑制浓度(IC_(50))分别为266.51,176.18,159.25μmol/L,48h的IC_(50),分别为158.84,161.27,125.67μmol/L,其药物作用强度为吡啶>吡嗪>Oxa,有显著性差异(P<0.01)。AnnexinV/PI双染法显示出三种药物均可诱导SW620细胞产生凋亡,其作用呈浓度和时间依赖性,并且随药物作用浓度及时间延长死亡细胞增多,作用强度为吡啶>吡嗪>Oxa,有显著性差异(P<0.01)。电镜下可见细胞典型早晚期细胞凋亡特征。结论:这两种新型铂(Ⅱ)配合物对结肠癌SW620细胞系显示出良好的体外抑瘤效果,该作用呈浓度和时间依赖性,并且强于奥沙利铂。药物作用靶点之一在于诱导细胞产生凋亡。

DR-nm23基因慢病毒表达载体的构建及其在人结直肠癌SW620细胞中的表达

目的:构建DR-nm23基因慢病毒表达载体及建立DR-nm23基因稳定表达的人结直肠癌SW620细胞系,为DR-nm23基因功能研究奠定基础.方法:应用逆转录聚合酶链反应方法筛选无内源性DR-nm23基因表达的人结直肠癌细胞系.通过AgeⅠ酶切获得DR-nm23cDNA片段,并将其交换连接到慢病毒表达载体pGC-FU中.慢病毒表达质粒pGC-FU-DR-nm23-GFP和包装质粒共转染293T细胞,孔稀释法测定慢病毒滴度.获得重组的慢病毒,感染人结直肠癌SW620细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白及Westernblot检测DR-nm23在SW620细胞中的表达.结果:低转移性结直肠癌SW480、HT29细胞DR-nm23基因高表达,而高转移性SW620细胞不表达.重组慢病毒质粒pGC-FU-DR-nm23-GFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的DR-nm23基因序列(NM_002510)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,慢病毒滴度为2E+9TU/mL.收集慢病毒上清液感染SW620细胞,荧光显微镜下观察85%细胞表达绿色荧光.感染后SW620细胞DR-nm23稳定高表达.结论:成功构建了携带DR-nm23与GFP融合基因的慢病毒表达载体pGC-FU-DR-nm23-GFP,获得了DR-nm23基因稳定表达的结直肠癌SW620细胞系.该细胞系可作为研究DR-nm23基因功能研究的可靠细胞模型.

上调DR-nm23表达对人结直肠癌细胞SW620生物学特性的影响

目的:探讨DR-nm23基因对人结直肠癌细胞SW620生物学特性的影响.方法:以无内源性DR-nm23表达组SW620、空白对照组SW620/mock和p GC-FU-DRnm23-GFP慢病毒转染组SW620/DR-nm23为实验对象,应用细胞体外实验及体内转移瘤模型检测分析DR-nm23转染前后对结直肠癌细胞增殖、运动、侵袭及转移能力的影响.结果:DR-nm23转染后能抑制SW620细胞的体外增殖能力,通过6 d连续比较,SW620/DRnm23、SW620/mock和SW620 3组细胞体外生长曲线(F=15.657,P=0.002)及平板克隆实验(F=45.476,P=0.003)差异有统计学意义.Transwell体外运动小室24 h穿过细胞数分别为SW620/DR-nm23组14.00±1.85,SW620/mock组18.00±2.01,SW620组17.00±1.98,3组差异有统计学意义(F=10.746,P=0.006).Boyden侵袭小室3组差异不显著.SW620/DRnm23组皮下成瘤能力(F=5.579,P=0.008)及肝转移能力较SW620/mock组及SW620组显著减弱.结论:外源性DR-nm23基因高表达具有抑制结直肠癌细胞SW620增殖、侵袭及转移的能力,因此可作为判断结直肠癌患者预后的潜在指标.

核因子κB在凝血因子Ⅶa促进结肠癌SW620细胞增殖迁移中的作用

目的探讨核因子KB（NF—κB）在促进结肠癌SW620细胞增殖迁移过程中的作用及其可能的机制。方法以凝血因子VIIa、NF—κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）等处理结肠癌细胞株SW620，采用Westernblot法检测细胞核NF—κB（p65）、细胞浆NF-κB抑制蛋白（IκB-α）和凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶7（caspase-7）的蛋白表达变化；采用流式细胞术检测SW620细胞的细胞周期变化；采用Transwell法测定SW620细胞的迁移能力；采用实时定量聚合酶链反应（PCR）检测白细胞介素8（IL-8）和组织因子（TF）mRNA的表达水平。结果凝血因子Ⅶa能够显著下调细胞浆中IκB-α的表达水平，并使细胞核内NF—κB的表达水平升高，单克隆抗TF和抗蛋白酶激活受体2（PAR2）抗体能够抑制凝血因子Ⅶa的这一作用。PDTC能够明显干预凝血因子Ⅶa对SW620细胞增殖、迁移的促进作用。PDTC能够明显干预凝血因子Ⅶa对SW620细胞中TF、IL-8mRNA表达的促进作用和对caspase-7蛋白表达的下调作用。结论凝血因子Ⅶa与细胞表面TF结合形成TF／Ⅶa复合物，活化受体PAR2，经NF—κB通路上调IL-8、下调caspase-7的表达，促进SW620细胞的增殖与迁移。TF／Ⅶa／／PAR2／NF—κB通路还可进一步上调TF的表达，从而形成TF／Ⅶa／PAR2／NF—κB／TF正反馈通路。

稳定表达Cas9蛋白的SW620细胞株构建

目的:建立稳定表达Cas9蛋白的SW620人结肠癌细胞系的单克隆细胞株,提高基因编辑效率,为利用基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选结肠癌相关致病基因提供细胞工具。方法:用Cas9慢病毒侵染SW620细胞系,用致死剂量的puro筛选5-7天,通过有限稀释法获得单克隆细胞株。提取单克隆细胞基因组进行Sanger测序,筛选出含有Cas9基因序列的单克隆细胞株。利用基于SSA修复荧光素酶的报告系统检测单克隆细胞株中Cas9的编辑活性,并通过细胞增殖实验检测Cas9蛋白的表达是否影响细胞增殖。结果:获得了两个表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,并通过Sanger测序验证了Cas9序列;荧光素酶报告系统检测显示单克隆细胞株的Cas9蛋白有较高的编辑活性;细胞增殖实验显示Cas9蛋白的表达对SW620增殖活性影响不大。结论:本研究利用慢病毒感染的方式,构建了稳定表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,为后续大规模筛选与人结肠癌相关的基因突变提供了细胞工具。