数据非依赖采集张量质谱数据计算平台的开发

数据非依赖采集张量(data independent acquisition tensor,DIAT)是一种质谱数据格式,用于处理和分析数据非依赖采集方法获得的蛋白质组学数据。与传统方法相比,DIAT技术具有便捷的数据可视化处理和高效的深度学习模型训练等优势。但由于目前缺乏支持DIAT格式数据的软件平台,限制了其应用。为解决这一问题,本文基于PyQt框架设计了一款用于处理和分析DIAT数据的软件,涵盖了与DIAT技术相关的所有功能,使用户能够轻松地利用DIAT数据进行复杂分析,降低了使用门槛,为数据非依赖采集(DIA)质谱数据分析注入了活力。

基于SWATH/DIA联合PRM技术筛选结直肠癌伴2型糖尿病血清诊断标志物的研究

目的筛选2型糖尿病(T2DM)合并结直肠癌(CRC)的血清诊断标志物。方法收集2019年6月至2020年1月就诊于本院、既往已确诊T2DM且本次经病理学确诊为原发性CRC的患者血清标本20例(T2DM+CRC组),确诊T2DM并排除各种恶性肿瘤的患者血清标本20例(T2DM组)。通过查阅病历获得患者一般资料和肿瘤标志物检测结果。随机选取两组各5例血清标本,采用数据非依赖采集(DIA)质谱技术检测血清蛋白质谱并比较两组间差异表达的蛋白;以此差异表达的蛋白建库,用平行反应监测(PRM)靶向质谱检测技术检测两组血清样本(各20例)中这些差异表达蛋白的水平。两组间差异比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney检验,相关性分析采用Pearson相关性分析,联合诊断效能分析采用Logistic回归分析,各项标志物的诊断效能采用受试者工作特征(ROC)曲线评估。结果DIA质谱检测获得两组间差异的表达蛋白共13个,其中7个蛋白上调、6个蛋白下调。以此13个蛋白建库进行PRM分析共筛选到6个候选蛋白,其中4个(APOC1、RBP4、IGFBP3和KAIN)的水平在两组间差异有统计学意义(P<0.05)。此4个差异表达蛋白与肿瘤标志物CEA联合应用可以在T2DM患者中精准鉴别CRC,曲线下面积达0.923(P<0.001)。结论APOC1、RBP4、IGFBP3和KAIN可能成为预测T2DM患者罹患CRC的特异性血清蛋白标志物,四者与肿瘤标志物CEA联合应用的诊断效能更强。

基于SWATH定量质谱技术的肥胖小鼠脂肪线粒体蛋白质组分析

目的揭示肥胖诱发脂肪组织线粒体蛋白质组的变化,并探索变化的可能机制,实现针对小鼠脂肪组织线粒体蛋白质组的深度测序和准确定量。方法利用数据依赖型(DDA)质谱方法鉴定小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织中的线粒体蛋白;利用新型SWATH(sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra)质谱技术定量肥胖小鼠和野生型小鼠不同脂肪组织中线粒体蛋白,同时对表达差异的线粒体蛋白进行功能分析。实验步骤:1用组织线粒体提取试剂盒特异性提取不同类型脂肪组织线粒体蛋白;2用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳预分离线粒体蛋白;3利用DDA方法建立线粒体蛋白质谱文库;4利用SWATH质谱方法定量线粒体蛋白;5利用Peak View2.0软件提取碎片离子色谱峰并进行积分计算其峰面积;6根据KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路和GO(Gene Ontology)功能分类分析肥胖小鼠和正常小鼠脂肪组织表达差异蛋白的生物功能。结果在白色脂肪组织和棕色脂肪组织分别准确鉴定并定量线粒体定位蛋白1000和1039种,3次生物学重复实验中共鉴定包括线粒体氨肟还原成分1在内的25种线粒体蛋白在白色脂肪组织特异性表达,包括非偶联蛋白3在内的21种线粒体蛋白在棕色脂肪组织特异性表达。肥胖小鼠与正常小鼠相比,白色脂肪组织中共有25种线粒体蛋白表达显著上调(上调倍数≥2,P<0.01),有47种线粒体蛋白表达显著下调(下调倍数≥2,P<0.01);棕色脂肪组织中有26种线粒体蛋白表达显著上调(上调倍数≥2,P<0.01),有21种线粒体蛋白表达显著下调(下调倍数≥2,P<0.01)。结论脂肪组织线粒体蛋白质组的定量及生物信息学的分析表明,肥胖导致线粒体内三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸的合成和降解以及对外源性物质的代谢等重要的信号通路发生紊乱,并准确鉴定、定量其相关表达差异蛋白,为肥胖导致代谢紊乱的机制研究提供重要的数据支持。

基于高效液相色谱-飞行时间质谱法SWATH采集模式快速筛查草莓中农药残留的方法研究

本研究利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-QTOF/MS)的SWATH采集模式,建立了快速筛查草莓中农药残留的新方法,并对其中的20种农药残留进行了定量分析。采用乙腈提取,用无水硫酸镁、氯化钠、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)粉净化提取液后上机,采用正离子模式采集全信息谱图,与谱库比对进行筛查,并且对其中的20种农药残留进行定量分析。结果表明,20种农药的检出限可达0.0002~0.01 mg/kg,在0.0005~0.1μg/mL范围内线性良好(R^(2)≥0.995),回收率为62.8%~106.3%。本方法快速简便、灵敏度较高,为非靶向筛查,可用于草莓中多种农药残留的快速筛查。

SWATH采集模式 蛋白质组学质谱应用新技术

6月6日,苏黎世联邦理工学院及AB SCIEX（全球领先的生命科学分析技术公司）的科学家汇聚一堂,公布了一项基于质谱应用的新技术,SWATH采集模式。利用此项技术,科学家有史以来首次可以获得单独蛋白质组学样品分析中每个肽段的数据。

UPLC-Q-TOF-HRMS技术结合SWATH采集方法同时测定柠檬果实中26种生物活性成分的含量

利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间高分辨质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight high resolution mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-HRMS)技术结合所有理论碎片离子的连续窗口采集(sequential window acquisition of all theoretical fragment ions,SWATH)模式,采用特征二级碎片离子峰面积进行外标法定量,建立了一种快速、灵敏同时测定柠檬中13种类黄酮、8种香豆素和呋喃香豆素、2种类柠檬苦素和3种酚酸物质的方法,并对6个品种柠檬果实的果皮、果肉和果汁中这26种生物活性成分进行了定量分析。方法学考察结果显示,该方法具有良好的线性关系、灵敏度、精密度和准确度:线性方程的相关系数均在0.99以上;定量限最低可达0.001μg/L;日间相对标准偏差和日内相对标准偏差分别不超过5.33%和6.39%;加标回收率为(84.27±3.02)%~(114.25±1.77)%。定量结果表明,不同品种与不同部位的柠檬样品中生物活性物质的含量存在较大差异。26种物质在6种柠檬果实中的含量排序为:柯尔提粗柠檬>里斯本柠檬>尤力克柠檬>美国粗柠檬>扁红柠檬>北京柠檬;果皮中的含量显著高于果肉和果汁,所测类黄酮的总含量在26种生物活性成分中占比最高,是柠檬生物活性成分的主要来源之一,其中橙皮苷的含量居首位;柠檬油素、橙皮油内酯、伞形花内酯是柠檬果实中含量较高的香豆素类物质。该研究建立的同时测定26种生物活性成分含量的方法适用于柠檬果实不同部位多类型生物活性物质的筛查和定量分析,方法灵敏、可靠、具有通用性,可用于植物源性产品中多类型生物活性物质的分析研究。

基于数据非依赖型采集质谱技术的血液脂质分子高通量分析

脂质是生物体的重要代谢分子,参与重要的细胞生物功能,已有报道表明环境中污染物会干扰生物体正常循环及代谢机制,导致脂肪代谢紊乱。基于数据非依赖型(DIA)采集质谱技术,通过优化UPLC-QTOF MS(超高效液相色谱飞行时间质谱联用)液相分离方法,开发了少量人体血液样品中脂质代谢分子的高通量分析方法,并将其应用于57个普通人群的血液样品分析,在10μL人体血液样品中检出2 598个信号,经脂代组学质谱库匹配解析鉴定出八大类1 780个脂质分子,其中分子数目占比最大的脂质为甘油磷脂类(37%),其次依次为脂肪酸类(23%)、固醇脂类(13%)、甘油脂类(10%)、鞘脂类(9.0%)、孕烯醇酮脂类(4.8%)。上述研究建立的脂质分子高通量分析方法为以脂质代谢为毒性终点的污染物毒性筛查和毒理机制研究提供方法学基础。

质谱定量蛋白质组学技术筛选结直肠癌外周血单个核细胞差异表达蛋白

结直肠癌(CRC)是一种常见的、发生及发展过程复杂的消化系统癌症,其复杂、多级的发生发展过程会影响机体免疫功能,引起免疫变化。外周血单个核细胞(PBMC)是机体免疫系统的重要组成部分,且便于获取,是研究机体免疫功能的理想材料。本研究采用最新的数据非依赖采集(data independent acquision,DIA)质谱新方法结合Skyline软件对结直肠癌患者与良性肠病患者的PBMC蛋白进行定量比较,寻找差异表达蛋白,并对差异蛋白进行Reactome通路及GO分析。结果表明,共找到113个差异表达蛋白,其中,上调蛋白23个,下调蛋白90个,它们参与巨噬细胞、T细胞、树突细胞等多种外周免疫细胞的免疫活动。在这些差异蛋白中,上调蛋白Galectin-1及下调蛋白Dok-2和AHNAK1等蛋白与机体的免疫功能息息相关,有望成为外周血单个核细胞中的结直肠癌免疫标志物。

SWATH/DIA联合PRM技术在2型糖尿病合并肺癌患者血清诊断标志物筛选中的应用

目的应用质谱技术(sequential window acquisition of all theoretical mass spectra,SWATH)联合平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术筛选早期鉴别2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)罹患肺癌(lung cancer,LC)的特异生物标志物。方法收集2019年6月-2020年1月就诊于南京医科大学附属无锡人民医院、既往确诊T2DM、且经病理学确诊为原发性早期LC的20例患者血清标本(T2DM+LC组),确诊T2DM并排除恶性肿瘤的20例患者血清标本(T2DM组)。2组随机各选取5份标本,采用数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)质谱技术分析血清蛋白质谱并分析两组间差异血清蛋白。采用PRM技术验证两组间的差异血清蛋白。通过logistic回归分析法探索鉴别T2DM患者罹患LC的最佳生物标志物组合。结果两组间共提取13个差异血清蛋白,其中9个蛋白上调,4个蛋白下调。对13个蛋白进行PRM建库分析,检测到7个候选蛋白,其中3个蛋白(PZP、IBP3、IGJ)含量两组间比较差异有统计学意义(P<0.05),具有潜在的诊断价值。3个候选蛋白联合鉴别T2DM患者罹患LC的线下面积(AUC)为0.860。结论SWATH/DIA联合PRM筛选特异性血清蛋白标志物PZP、IBP3、IGJ可用于T2DM患者罹患LC的早期诊断,三者联合应用诊断效能更强。

血浆代谢组同时定性定量分析方法研究

数据非依赖的质谱采集是近年来发展的一种新型多级质谱分析方法,只需一次进样便可同时快速获取所有母离子及其子离子信息。本研究以肺癌血浆样本为研究对象,采用数据非依赖的SWATH(sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions)采集技术,建立了液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时定性定量分析血浆代谢组。基于代谢物数据库识别比对,成功识别了93个代谢物,实现了代谢物的定性分析。对成功识别的代谢物建立定量分析方法并进行方法学考察。结果表明,其中90个代谢物的线性相关系数大于0.99,定量限在1.25~12000μg/L之间;其中有86个代谢物可以满足生物样本定量分析的要求,其连续4天的日内精密度和日间精密度均小于20%;在4℃下,96 h内的放置稳定性在0.62%~19.35%之间。该方法的覆盖率高,能同时快速准确地对肺癌血浆中癌症相关代谢物进行定性定量分析,也适用于其他生物样品,可以为定量代谢组学分析提供重要的方法学平台。

血浆中85种有毒生物碱快速筛查方法的建立及其应用

目的 利用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱建立血浆中85种有毒生物碱快速筛查方法。方法 构建85种生物碱高分辨数据库;血浆经乙腈沉淀蛋白进行预处理,采用Acquity Waters BEH C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),以5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)和乙腈为流动相进行梯度洗脱,对比了3种数据采集方式下(Full mass/dd-MS~2、Full mass/AIF、Full mass/DIA)加标血浆中85种有毒生物碱筛查情况。结果 血浆在5、50和250 ng/mL 3个浓度添加水平下,Full mass/DIA模式下的筛选准确率均为最高。利用生物碱数据库,选择Full mass/DIA模式采集样品数据信息,建立了血浆中85种有毒生物碱快速筛查方法。80%以上生物碱在血浆中的检出限低于10 ng/mL。利用该方法成功在滇乌头碱毒物代谢动力学实验获得的3份Wistar大鼠血浆中筛选到了目标物滇乌头碱及其可能的代谢产物脱氧乌头碱及印乌头碱。结论 该方法快速、高效,可以在无标准品情况下实现突发性有毒生物碱中毒血浆的快速筛查。