麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因在真核细胞中共表达研究

以山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室克隆的pG-F和pG-HN质粒为模板,PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个柔性氨基酸构成的柔性短肽作为Linker将F及HN基因片段体外连接,插入pCI-neo真核表达载体,构建麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因共表达载体pCI-F-HN,并在Vero细胞中转染表达,进行间接免疫荧光检测。结果显示,麻鸡新城疫病毒SX-1株F-HN组合基因在Vero细胞中得到较高水平的表达,在荧光显微镜下能够观察到较强的荧光,说明F-HN组合蛋白具有良好的反应原性。为下一步研究高效亚单位基因工程苗奠定基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)突变体的构建及活性鉴定

本试验旨在构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SX-1株非结构蛋白Nsp1的真核表达质粒,并对Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)进行定点突变,检测其在真核细胞中的表达活性。利用TRIzol法提取总RNA,RT-PCR扩增Nsp1目的基因,经双酶切构建pCI-neo-Nsp1真核表达质粒后对Nsp1蛋白锌指结构1的8C、10C、25C和28C的4个位点进行定点突变,成功获得分别突变为A和S的8个突变体。转染HeLa细胞,通过间接免疫荧光方法(IFA)和Western blotting检测Nsp1蛋白的活性。IFA结果显示,Flag抗体检测时蛋白质主要分布在细胞质和细胞核中,Myc抗体检测时蛋白质主要分布在细胞核中。Western blotting结果显示,Flag抗体检测时,S突变体出现大小约为44和20ku条带,A突变体出现约为44ku条带;Myc抗体检测时,S突变体出现大小约为44和27ku条带,A突变体出现大小约为44ku条带。试验结果表明,本试验成功构建了Nsp1突变体的真核表达质粒,证实其能在真核细胞中表达,为进一步研究Nsp1蛋白的锌指结构是否对机体Ⅰ型IFN产生起下调作用提供基础。