猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)和禾谷镰孢(F.graminearum)等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×103copies/μL,real-time PCR的灵敏度可达到6.5×102copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在T m为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x+39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,3个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。研究表明,所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。

猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank已发表的HCV 5’NTR核苷酸序列设计一对特异性引物，扩增位置在整个基因的221～377位，片段长度为167bp。提取由厦门出入境检验检疫局技术中心动物实验室保存的HCV细胞毒的RNA，并反转录成cDNA，以此cDNA为模板建立了SYBR Green I实时定量PCR检测猪瘟病毒的方法，并用该方法检测送检的临床疑似病料。结果表明：本研究建立的HCV-SYBR Green I PCR特异性强，与FMDV、PCV2、PRRSV、PPV、PRV等常见猪病毒病病原没有交叉反应；灵敏度高，可以检测到5．3×10^2的病毒拷贝数；操作简单，耗时短，只需3h即可完成整个试验过程，可初步用于临床检测。

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

鸡毒支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在1.96×10~8拷贝/μL^1.96×10~2拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96×10~1拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40%,敏感性明显高于常规PCR(33%)和血清平板凝集试验方法(23%),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×10~7拷贝/μL。该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术。

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为60℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰,扩增所得标准曲线为y=–3.331x+37.48,相关系数为0.998,扩增效率为1,最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

转基因产品中bar和pat基因的SYBR Green I-PCR检测方法研究(英文)

SYBRGreenI是一种在实时定量PCR检测中广泛使用的DNA结合染料。PCR结果可以通过溶解曲线分析来鉴定而不再需要使用传统的琼脂糖凝胶电泳来鉴定,因为PCR特定扩增产物的溶解温度的特异性是类似于琼脂糖凝胶电泳中的扩增条带的特异性。建立了基于扩增产物溶解曲线分析的二重实时定量PCR对转bar和pat基因的作物进行检测的方法。获得了bar和pat基因的特异性扩增产物和他们的特定溶解温度,并且通过几组不同的二重PCR对他们的扩增产物进行了溶解曲线鉴定。还对影响溶解曲线分析的一些因素进行了研究和讨论。结果表明基于扩增产物的溶解温度建立的二重PCR检测方法是可行的,该方法对转bar和pat基因的作物可达到0.9%的检测限。

SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒基因方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光PCR快速检测登革热病毒的方法。方法以通用引物对标准株提取物和血清样本进行RT-PCR扩增,同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增,分析其灵敏性特异性和重复性。结果标准毒株的扩增结果与预期结果相同,测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致。实验的灵敏性特异性和重复都较高。结论SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法,但它更适用于早期传染病监测。

梭子蟹肌孢虫SYBR Green I实时定量PCR检测方法的建立与应用

梭子蟹肌孢虫(Ameson portunus)是感染三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的常见病原之一,该研究以其SSU rRNA基因为靶标建立了SYBR Green I实时定量PCR检测方法。结果显示:该方法扩增效率为101.45%,检测灵敏度下限可达2.0×10~1拷贝·μL^(-1),特异性、组内重复性和组间重复性均好。利用该荧光定量PCR方法对一批来自"牙膏病"流行区的养殖三疣梭子蟹样品进行检测,梭子蟹肌孢虫检出率为82.35%。检测结果显示,活蟹的每毫克肌肉平均带虫量大幅低于死蟹,表明该地区梭子蟹的死亡与肌孢虫的感染密切相关,而且,当梭子蟹肌孢虫载量达到1.0×10~9拷贝·mg^(-1)时三疣梭子蟹存在暴发疾病甚至死亡的风险。另外,通过对比检测发现,梭子蟹肌孢虫套式PCR方法对这批样品的检出率为64.71%,表明该研究建立的荧光定量PCR方法具有更高的灵敏度。

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。

一种基于汞特异性DNA和SYBR GREEN I荧光检测Hg^(2+)方法的建立

以富含胸腺嘧啶(thymine)的Hg^(2+)特异性DNA为识别元件,利用SYBR GREEN I分子光"开关"的特性,建立了一种高灵敏、高选择性荧光均相检测Hg^(2+)的新方法。该检测体系由两条非标记、含有5个thymine-thymine(T-T)错配碱基对的DNA探针组成。T-T错配使两条DNA探针以单链形式存在于溶液中,而Hg^(2+)通过T-Hg^(2+)-T配位作用可以与两条DNA探针结合并形成稳定的双链结构。在优化条件下,荧光强度与Hg^(2+)浓度在0-100 nmol/L范围呈线性,检测限为2nmol/L(S/N=3),而其他金属离子也不会对Hg^(2+)检测造成干扰。该方法简单快速,有望应用于水体中Hg^(2+)的检测。

延边白鹅CD4与CD8基因SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立延边白鹅CD4与CD8基因在细胞免疫中的动态变化的检测方法,本研究根据CD4与CD8基因保守区分别设计两对特异性引物,在克隆目的基因的基础上,进行TA克隆和转化,构建的阳性质粒作为标准品,经反应条件优化建立了检测延边白鹅CD4与CD8基因的荧光定量PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法在质粒标准品稀释倍数为101~108倍(CD4:1.2×10^8拷贝/μL^1.2×10^1拷贝/μL;CD8:1.8×10^8拷贝/μL^1.8×10^1拷贝/μL)范围内具有良好的线性关系,相关系数均为0.999,与其它相关鹅细胞因子基因不发生交叉反应,敏感性均是普通PCR的100倍,组内和组间变异系数均小于2%。初步应用本研究建立的方法检测鹅脾脏淋巴细胞CD4与CD8基因的转录水平,结果显示ConA可诱导目的基因转录水平升高,且显著高于PBS对照组(p<0.05)。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法为进一步研究鹅细胞免疫水平和CD4、CD8生物学活性奠定了基础。

Establishment and Application of a SYBR Green I Real-time Quantitative PCR Assay for the Detection of LAT Gene of Pseudorabies Virus in Bama Miniature Pigs

[ Objective] This study aimed to establish a rapid, sensitive and specific SYBR Green I real-time quantitative PCR assay for the detection of latent pseudorabies virus （PRV） infection. [ Method ] SYBR Green I real-time quantitative PCR conditions and system for early detection of latent pseudorabies virus in- fection were optimized and compared with conventional PCR to investigate the sensitivity and specificity. Subsequently, the established assay was applied to detect different clinical samples. [ Result] The sensitivity of SYBR Green I real-time quantitative PCR assay （52 copies/μl） was 1 000 times higher than that of conven- tional PCR （5.2×1^04 copies/μl） and the detection time was shortened by 1/2. The established assay could be used to detect PRV but could not be used to detect PCV2, PPV, CSFV or PRRSV. Various tissues were collected from Bama miniature pigs with latent PRV infection under sterile conditions for real-time PCR detection. Results showed that viral copy number in the brain, nasal swab, inguinal lymph node, liver, lung and spleen was above 20, while PRV was not detected in the kidney and heart tissues. [ Conclusion] The established SYBR Green I real-time quantitative PCR assay for PRV/.AT detection was specific, sensitive and rapid, which could be used for pathogen monitoring, epidemiological investigation and quantitative study of PRV.

鸽I型腺病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。

SYBR Green I荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR Green I荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium.MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插人序列ISI311为检测靶标设计引物,在60 C的退火温度下,建立鉴定MA的SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA.检测限为5.6x 102 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列ISI311为基础建立的SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法。方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果 该法检测的线性范围为6.4×10^1～6.4×10^7拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×10^3拷贝/反应的标本批内变异系数（CV）和日间CV分别为1.6%和2.8%。熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为（80.40±0.18）℃。结论 SYBR Green I实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-1的进一步研究奠定基础。