水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

猪脑心肌炎病毒SYBR GreenⅠ real-time PCR检测方法的建立

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测EMCV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.991;对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍;与其他猪源病毒,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于3%。应用建立的方法检测了17份临床可疑病例的心、脑组织样本,结果1份为阳性。表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的病原检测及定量分析。

猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α SYBR GreenⅠ real-time PCR检测方法的建立

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR GreenⅠreal-ti me PCR方法。该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102copies/μL外,其他均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA的表达水平进行了检测。结果表明,建立的real-ti me PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-ti mePCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。

基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立

目的本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR GreenⅠ,通过茎-环法设计原理,建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法。方法利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列,分别设计1条miR-7特异性反转录引物,以及Real-time PCR上游和下游引物;观察不同退火温度和不同引物浓度对扩增miR-7的Ct值影响,选择最优的退火温度和引物浓度;测定不同稀释度RNA下Real-time PCR扩增miR-7的效果;并利用该方法检测小鼠4个器官中miR-7的灵敏性和特异性。结果在基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR检测法中,miR-7扩增的最优退火温度为60℃,最优引物浓度为10μmol/L;在不同稀释度RNA下miR-7的Ct值线性关系较好,且在模板RNA低于100 pg的条件下,该方法仍可有效检测miR-7分子;最后有效检测出小鼠4个不同器官中miR-7的差异性表达。结论成功建立基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7的方法,可为后续研究miR-7的生物学功能提供了重要工作基础。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

寨卡病毒SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的建立及应用

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。

SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响

目的建立SYBR GreenⅠReal-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响。方法提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR GreenⅠReal-time PCR检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。运用建立的SYBR GreenⅠ方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较。结果 SYBR GreenⅠReal-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107~102copies,检测灵敏度可达102copies。IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性。SYBR GreenⅠ方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义。结论 SYBR GreenⅠReal-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要。

猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

猪圆环病毒(PCV)包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)。近些年来,PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染,因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR鉴别检测方法显得尤为必要。本试验通过特异性引物筛选,各项反应条件优化,建立了实时荧光定量PCR鉴别方法。结果表明:PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL。与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。批内及批间变异系数均小于1%。对98份PCV疑似阳性病料检测结果表明,PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%,共感染率为7.1%。该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

利用SYBR Green检测衣原体Real-Time PCR方法的建立

利用SYBR Green建立了检测种特异性衣原体的Real-Time PCR方法。本方法应用衣原体种特异性的高度保守特异引物，能够扩增627bp特异片段；使用定量标准基因组DNA，本方法能准确检测最少250fg衣原体DNA。Real-TimePCR方法与免疫荧光方法的检测结果表明：检测4种衣原体临床样本，Real-TimePCR敏感性均在96％～98%；特异性均为100％；这两种方法符合率达97％以上（n=60）；批内和批间重复性试验结果表明，本方法具有良好的准确性。本方法的建立对于快速、准确检测临床样本种特异性衣原体提供了一种切实有效的方法。

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法,本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物,分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对2种方法进行了综合比较。结果显示,TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10^(1) copies/μL和1.0×10^(2) copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性;重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品,2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明,2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。

鳗鲡圆环病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein,RAP)基因的保守序列设计特异性引物,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,C t值)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广(1.0×108~102拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增;重复性强,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现,在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织;对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测,阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。

空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数(CV)均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。

Ⅰ群禽腺病毒SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物，建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法。用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示。该方法可检测到每个反应相当于1×10^2个拷贝的标准品DNA，与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应，具有良好的重复性。对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测，结果都为阳性，检测的病毒含量为1×10^6～1×10^8拷贝／μL。表明．建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR GreenⅠ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性。应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、142、1 d分别采集全血,检测结果均为阳性。证实,本试验所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株。

基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术

生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。

牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。

猪瘟病毒强毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为准确快速诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,简称CSFV)强毒,对GenBank已公布的CSFV的基因组全序列进行分析,根据CSFV-5'NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物,建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明,该法具有很好的敏感性,对猪瘟病毒最低检出量为10拷贝/μL;特异性强,与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒(简称PRV)、猪细小病毒(简称PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(简称PRRSV)、圆环病毒组织苗(简称PCV2)没有交叉反应;重复性好,变异系数(CV)为0.47%~1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。