小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并进行验证,以进一步应用于疫苗免疫效果评价。方法根据幽门螺杆菌尿素酶B亚基（urease B,Ure B）在各菌株中相对保守的特性设计引物,优化其扩增条件,建立幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并对方法的专属性、精密性、准确性及检测限进行验证。结果所设计的引物在阳性样本中可特异性地扩增出目的基因片段,且小鼠胃部中其他菌体的存在不影响反应结果的特异性。标准品质粒DNA模板含量在1×10^7-1×10^2拷贝/μl范围内线性良好,相关系数r^2大于0.995,扩增效率在90%-110%之间。应用于小鼠胃组织幽门螺杆菌检测,具有较好的准确性和精密性,回收率为96.25%-101.42%,试验内和试验间相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均小于6%。用该方法检测高、中、低浓度的Hp菌液、并模拟定量Hp菌株在小鼠胃组织中的状态,试验内及试验间RSD均小于6%,精密度良好。其回收率大于80%,与平皿计数法一样,但灵敏度显著高于平皿计数法。结论 SYBR GreenⅡ实时定量PCR法快速有效,专属性良好,线性范围广,可重复性好,使用方便,可用于定量检测幽门螺杆菌在小鼠胃部组织中的定植,从而进一步应用于评估免疫反应对细菌定植的影响。

猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对猪腺病毒3型（PADV3）的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×10^2-3.7×10^9 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%-1.23%,组间变异系数为0.73%-2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

Ⅱ型猪圆环病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

登录GenBank下载猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)的全基因组序列,根据其保守区域,设计1对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立该模式的实时定量PCR检测方法,构建了检测PCV-2型的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102～1.0×107拷贝·μL-1浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999。该方法用于猪圆环病毒2型的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪圆环病毒2型的快速检测。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

猪戊型肝炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种快速检测猪戊型肝炎病毒(HEV)的方法。方法针对HEVORF2基因保守序列设计1对引物,基于SYBR GreenⅡ染料,建立了检测HEV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法只能对猪戊型肝炎病毒检测到荧光,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒均不能检测到荧光信号,特异性好;检测HEV时,在4.10×10~2~4.10×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,灵敏度可以达到1.00×10~2拷贝/μL,扩增相关系数为0.996,扩增产物的熔解温度为84.0℃±0.1℃,该检测方法组内变异系数为0.83%~0.94%,组间变异系数为0.83%~0.94%,重复性较好。利用该方法对临床61份来自四川各地的猪肠内容物进行检测,检出9份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结论建立的针对HEV的荧光定量RT-PCR有效可行,对HEV的临床检测和进一步研究奠定了基础。

3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。

SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。

三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPCR方法阈值循环数(cycle threshold value,Ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;Ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PCR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。

猪源MHC Ⅱ类分子反式激活因子CIITA SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

啮齿类螺杆菌SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种啮齿类螺杆菌(helicobacter rodentium)的快速检测方法。方法根据啮齿类螺杆菌16SrRNA的基因序列设计了1对特异性引物,建立了啮齿类螺杆菌SYBR GreenⅡ荧光定量PCR检测方法。结果在10~2拷贝/μL～10~7拷贝/μL浓度范围中标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法特异性良好,仅对啮齿类螺杆菌产生特异性扩增,且灵敏度可达到30拷贝/μL,组内和组间的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。结论建立了SYBRGreenⅡ荧光定量PCR检测啮齿类罗杆菌的一种方法 。

Development and application of a SYBR Green I fuorescent PCR assay for the diferentiation of genotypes I and II African swine fever viruses

African swine fever(ASF)is a highly fatal hemorrhagic disease afecting domestic pigs caused by African swine fever virus(ASFV).Genetic analysis of ASFV isolates to date has identifed 24 geographically related genotypes with various subgroups,but only genotype I and II ASFVs have been reported outside Africa.ASFV genotype II and genotype I viruses were reported in China in 2018 and 2021,respectively.In this study,unique and highly conserved noncoding regions were found between MGF_505-9R and MGF_505-10R in the 188 genomes of ASFV genotypes I and II.A pair of primers was designed on the basis of this region.By optimizing the reaction system and conditions,a SYBR Green I fuorescence PCR assay that can distinguish between ASFV genotypes I and II was established,and the sensitivity,reproducibility and specifcity were evaluated.The detection limit was 1 TCID_(50)/0.1 mL for both genotypes,with no cross-reactivity observed with other common pig pathogens.The intra-and interbatch variation coefcients were both less than 1.2%.Clinical sample detection analysis revealed 47 positive cases out of 100,including 3 for genotype I and 44 for genotype II,aligning with results from the WOAH-recommended and national standard methods.The method developed in this study allows for the diferentiation of ASFV genotypes I and II without the need for genome sequencing,ofering a convenient and rapid approach for ASFV detection and genotype identifcation.

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)和禾谷镰孢(F.graminearum)等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×103copies/μL,real-time PCR的灵敏度可达到6.5×102copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。

基于SYBR Green I的双链DNA定量方法

基于SYBR Green Ⅰ荧光染料与双链DNA（dsDNA）结合产生荧光的原理,建立一种高精度、高通量的双链DNA定量方法。将梯度稀释后的基因组DNA及已知浓度的λDNA与等体积的SYBR Green Ⅰ（4×）充分混合后,利用荧光定量PCR仪采集荧光信号,以ROX（1×）作为校正染料进行定量分析;同时利用紫外分光光度计对样品进行平行测定,比较该方法与紫外分光光度法的检测限与准确度。紫外分光光度法的检测限为2ng/μl,而SYBR Green Ⅰ荧光定量法的检测限可达到0.015ng/μl,并且在0.015-2ng/μl范围内,SYBR Green Ⅰ荧光强度与λDNA浓度呈线性关系（R2=0.9999）,比紫外分光光度法灵敏100倍以上,并可准确定量低纯度的DNA样品。此方法具有重复性好、高通量的特点,仅需少量的生物样本即可满足定量要求,为分子生物学研究及临床检验等多个领域提供了一种可靠的dsDNA定量方法。

四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 。