为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。...为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。展开更多
试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作...试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。展开更多
为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并...为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。展开更多
根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线...根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。展开更多
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将...【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。展开更多
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
文摘试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。
文摘为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。
文摘根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。
文摘【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。