鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立鸽圆环病毒(PiCV)的快速检测方法,依据PiCV Rep基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速检测PiCV的荧光定量PCR方法。结果显示,构建的PiCV荧光定量PCR方法在1.44×10,1~1.44×10^(7)/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9866;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为14.4拷贝/μL;该方法特异性良好,与鸽新城疫病毒、鸽疱疹病毒、鸽腺病毒等病毒及鸽组织DNA不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内重复试验变异系数均介于0.454%~0.473%,批间重复试验变异系数均介于0.367%~0.869%。与传统普通PCR方法相比,所建立的PiCV荧光定量PCR方法敏感性更高,临床样品PiCV检出率更高,两者检测符合率为93.75%。结果表明,所建立的PiCV荧光定量PCR方法为临床检测鸽圆环病毒提供了一种快速、灵敏的检测方法,为PiCV的流行病学调查和主动监测提供了技术支撑。

TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明:重组质粒建立的标准曲线相关系数为99%;可以同时鉴别检测TTV1和TTV2,检测PCV2和PRRSV阳性样品均呈阴性,表明该方法具有良好的特异性;最低检出量为10 copies/μL;重复试验结果显示,TTV1组内和组间变异系数分别为0.14%和0.74%;TTV2组内和组间变异系数均为0.13%;检测现地采集的189份样品,TTV1阳性率32.3%,TTV2阳性率6.3%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率28.6%。TTV检测方法的建立为猪群TTV病的流行病学调查提供了有效的手段。

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.

猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)g I/g E基因序列,设计一对特异性引物,建立了鉴别PRV野毒感染的荧光定量PCR方法。该方法灵敏度达到102拷贝/μL,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙脑病毒(JEV)不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;用PRV强毒攻毒仔猪,荧光定量PCR比普通PCR能更灵敏检出组织带毒量。该方法可以用于猪的组织样品,如脑、肺、扁桃体、淋巴结等样品中伪狂犬野毒的定量,可用于临床伪狂犬野毒感染的早期检测和定量分析猪伪狂犬病毒感染程度。

荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用效果

目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR技术检查。以染色体核型分析为标准,分析QF-PCR技术在产前诊断中的应用价值。结果388例受检羊水中,QF-PCR检测出其中1例母血污染。388例受检者中QF-PCR共检出17例染色体非整倍体异常,包括21三体异常10例,18三体异常2例,13三体异常1例,性染色体异常4例。与染色体核型分析结果相符,染色体核型分析结构异常13例,QF-PCR技术均未检出。结论QF-PCR技术能鉴别母血污染以及检查快速,可弥补染色体核型分析时间长的不足;而染色体核型分析可补充QF-PCR技术对其他染色体异常检测的不足,两种方法联合使用可起互补作用,利于减少出生缺陷。

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到103拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。

基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件,并确定通道间的补偿矩阵,可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得,还没有一种简单的方法可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵,减小计算量,采用主成分分析法(PCA)中确定主成分的方式,基于搭建的测试平台进行单一染料实验,获得染料的荧光信号在各个检测通道的分布情况,计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵,发现对于搭建的硬件系统,Cy5染料对Cy5.5通道串扰较大,串扰比例为8.76%,同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大,比例约为6.2%;其次是ROX染料对HEX通道串扰,比例约为2.68%;HEX染料对FAM通道串扰,比例约为1.58%;FAM染料对HEX通道串扰相对较小,比例约为0.25%,其余通道无明显串扰,与荧光光谱反映的结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理,有效去除了非目标通道的荧光串扰,实现了荧光通道数据的解耦,验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验,将不同浓度的多种染料进行组合测试,并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明,荧光通道各自的线性相关性较高,五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99,该结果进一步验证了该补偿方法的有效性。

5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10^(1)~1×10^(9),批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%~100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所建立的荧光定量PCR方法灵敏、特异、稳定,能够同时、快速区分检测上述5种猪源消化道传播病原体,可为猪肉制品从产地到餐桌全环节样品的监测提供有力的技术支持。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术

【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

样本的病毒核酸浓度与其荧光PCR反应检测Ct值关系分析

为基层兽医实验室制备盲样时,发现特定浓度的核酸通过倍比稀释,其荧光PCR反应的Ct值显示一定的规律性,即存在两个核酸浓度区间,分别是初始浓度与某个浓度之间(区间1)、该浓度与终末稀释浓度(区间2),且区间2内一部分核酸的Ct值比区间1的Ct值低;两个区间内,随着核酸浓度的降低,检测到的Ct值增大。这表明荧光PCR反应检测的Ct值与核酸浓度密切相关,同时也提示在制备病毒滴度低的样本时,需谨慎处理。本研究为增强核酸检测灵敏度提供参考。

狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。

荧光定量PCR在转基因农产品检测中的应用与优化

基因工程技术持续演进过程中,研究人员逐渐认识到转基因食品在满足人类需求方面的巨大潜力。本文旨深入探讨实时荧光定量聚合酶链式反应技术在转基因食品检测领域的应用现状。详细分析该技术的运用原理并提出优化建议。随着技术的持续创新,PCR技术能在提升检测效率、优化成本控制和增强检测精确度等方面实现更大的进步,从而为保障转基因食品安全,推动基因工程技术的稳健发展。

Sharpie marker在试管上标记对荧光PCR检测Ct值的影响

为了探明Sharpie marker在试管上标记对荧光PCR检测Ct值的影响,本试验模拟现实工作中可能遇到的各类情形,从Sharpie marker标记试管的各种方式,以对照组、全黑管、管壁全黑管、管壁和盖半黑管、管壁半黑管、盖半黑管和盖全黑管等为对象,通过荧光PCR检测,比较分析Ct值。结果显示,全黑管和盖全黑管对Ct值的影响最大,管壁和盖半黑管与盖半黑管对Ct值的影响较大,而管壁全黑管和管壁半黑管对反应Ct值没有影响。本研究为正确使用Sharpie marker,确保荧光PCR检测结果的准确提供了参考。

SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenI实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病。[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物。利用阳性质控品建立SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线。[结果]最佳引物终浓度为0.5μmol/L。所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5×10-8μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃。建立了标准曲线,其r2>0.99。