蛳鱼诺卡氏菌SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。

鸭RLRs和IFN基因SYBRGREENⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

首次建立以 GAPDH 为内参，同时检测鸭 RIG-I 、MDA5、IFN-α和 IFN-γ等4种 mRNA 相对表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 方法（RT-FQ-PCR）。以目的基因的克隆质粒为标准品，建立标准曲线，并进行熔解曲线、重复性及稳定性分析。该方法 Ct 值线性范围为12．0～32．0；目的基因（RIG-I 、MDA5、IFN-α、IFN-γ）和内参基因（GAPDH）的扩增效率均在95％～105％，其相关系数均在0．99以上；扩增产物的熔解曲线都只出现1个特异性单峰，无引物二聚体或其他非特异性产物生成，RIG-I 、MDA5、IFN-α、IFN-γ和 GAPDH 的 Tm 值依次为（81．9±0．33）、（81．9±0．32）、（93．6±0．23）、（81．8±0．28）、（87．8±0．24）℃，其敏感度均达到100 copies·μL－1，重复性和稳定性好，为从 mRNA 水平上深入研究 RIG-I 样受体、干扰素与鸭机体免疫功能相关性奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,分析氟胁迫条件下(0.42 mmol·L^(-1)NaF)8个候选内参基因(CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC)在茶树不同叶位(新梢和老叶)、不同胁迫时间(0、1、3、7 d)的表达稳定性。结果显示,在氟胁迫条件下,茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN,老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因(CsFEX)的表达情况,发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致,说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

采用实时荧光定量PCR法检测大曲中的3种高温放线菌

建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特异性单拷贝核心基因recA、mdH、gyrA为参考序列分别设计了一对可扩增278、233、291 bp片段的引物;经特异性、有效性、准确性实验显示,在常见的13种白酒酿造微生物中,引物TV、TI、TD分别可特异性检测T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus,检测范围为2.82~8.82 lg copies/μL,加标回收率95%~105%。进一步对大曲发酵过程样品检测,结果显示,T.vulgaris含量在呈现波动趋势,在第5天达到最高,为(6.06±0.02)lg copies/g;T.intermedius含量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到最高,为(6.33±0.13)lg copies/g;T.daqus含量在0~12 d呈现波动趋势,在12~14 d下降,随后一直上升,发酵结束时含量最高,为(7.62±0.02)lg copies/g。该研究建立的RT-qPCR方法可对大曲发酵过程中3种高温放线菌进行特异性鉴定和快速定量,为进一步监测高温放线菌在白酒酿造过程中的功能提供了方法。

非生物胁迫下黄缨菊实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

为了筛选基因分析中黄缨菊(Xanthopappus subacaulis)稳定表达的内参基因,本研究以冷、盐和干旱胁迫下黄缨菊的根、茎和叶为材料,依据三代转录组数据选取8个常用内参基因(18S rRNA,GAPDH,PAL,UBQ,TIP,RPS,SAND,TUA)作为候选基因,利用qRT-PCR技术并结合geNorm,NormFinder,BestKeeper和RefFinder软件综合评价候选内参基因的表达稳定性。结果表明,冷胁迫下黄缨菊根、茎、叶中最佳稳定性的内参基因分别为SAND,TIP和GAPDH;干旱胁迫下最稳定的内参基因分别是SAND,TUA和UBQ;盐胁迫下稳定性最好的内参基因分别为RPS,RPS和SAND。此外,分别以干旱胁迫处理下黄缨菊根、茎、叶中2个稳定性最佳和1个稳定性最差的基因作为内参基因,衡量耐逆基因WRKY表达量的准确性,表明不同胁迫下筛选出的黄缨菊不同组织中内参基因的稳定性结果均是可靠的。研究结果为今后黄缨菊耐逆基因的表达分析提供了基因资源和理论依据。

牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列,设计了特异性引物对FP.F/FP.R,并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法;运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量,验证其检测效果。结果表明:设计的引物FP.F/FP.R特异性强,RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL,重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法,可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明,3组样本的总阳性检出率均为100%。同时,植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此,本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测,为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。