感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。

4种甲醛对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活动力学的比较

目的观察4种甲醛对脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株的灭活效果。方法用4种甲醛(终浓度为92.5μg/mL)对3批脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株进行灭活,微量滴定法测定病毒感染性滴度进行病毒灭活验证实验,绘制灭活动力曲线;酶联免疫吸附测定法检测灭活病毒液D抗原含量。结果 4种甲醛对3批脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株灭活后,病毒感染性滴度均成下降趋势。在37°C灭活1 d滴度直线下降1 000 CCID50/mL以上,灭活到第4天均检测不到病毒;灭活后的病毒液D抗原含量回收率均大于80%,且4种甲醛对3批脊髓灰质炎病毒灭活后抗原影响无差异(P>0.05)。结论 4种甲醛对脊髓灰质炎病毒Sabin株样品灭活彻底,对脊髓灰质炎病毒Sabin株的D抗原破坏小,能较好地保持疫苗的有效成分,为甲醛质量控制及供应商筛选提供依据。

MAPREC与MNVT评价Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒神经毒力的比较

目的用PCR扩增及限制性酶切分析突变技术(MAPREC)和猴体神经毒力试验(MNVT)评价同一批Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力的结果差异。方法采用MAPREC技术,检测Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力关键位点472位点突变率;采用MNVT病理切片分析,评价Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力。结果 MAPREC检测待测样品核酸472位点突变率均值为0.324%,低于高突变参考品的0.621%。MNVT切片结果分析表明,xtest–xref=0.169,小于C1。对同一批样品,MAPREC与MNVT分析结果一致。结论在Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力检测方面,操作简单,试验周期短的MAPREC技术可作为金标准MNVT的有益补充。

Sabin株脊髓灰质炎病毒经透析处理后病毒回收效果评价

目的采用透析法对Sabin株3个型别的脊髓灰质炎病毒收获液进行透析后的病毒回收效果评价。方法高病毒滴度时,对Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液分别进行透析,比较每个型别病毒收获液透析前后的病毒感染性滴度回收率,及透析后的甲醛清除率;低病毒滴度时,选取101、100、10-1 CCID_(50)/mL 3个滴度的Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒液,分别进行透析,将相同型别及滴度的透析前后样品接种至Hep-2细胞上进行3次传代,比较透析前后细胞病变比率及病毒滴度。结果高病毒滴度时,各型别病毒收获液透析后与透析前相比,样品体积和感染性滴度均未发生较大变化(P>0.05),透析后甲醛清除率达99%以上。101 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,各型别病毒3次传代均能100%引起细胞病变;100 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒第1次传代引起细胞病变比率分别为66%、33%和33%,第2、3次传代均能100%引起细胞病变;10-1 CCID_(50)/mL低病毒滴度时,3个型别病毒3次传代均不能引起细胞病变。所有细胞病变后检测病毒滴度均在6.0 lgCCID_(50)/mL以上。结论 Sabin株3个型别的病毒收获液经透析后,活病毒的回收率较高,基本无损失,透析法可作为该病毒的纯化方法。

动态浊度法检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗及其中间产品中细菌内毒素含量

目的:建立一种用于检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗及其中间产品中细菌内毒素含量的方法。方法:应用细菌内毒素动态试管检测仪检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗及其中间产品中细菌内毒素含量,并对方法的标准曲线可靠性、准确度、精密度和耐用性进行验证。结果:细菌内毒素含量在0.125~2EU/ml范围内,标准曲线回归方程为LgTg=2.918-0.2760LgC(∣r∣=0.9964);干扰试验中,供试品细菌内毒素含量回收率为62.82%~101.04%;准确度试验中,供试品细菌内毒素含量回收率为64.54%~93.74%;精密度试验中,3名实验人员测试的平均反应时间相对标准偏差(RSD)均小于4%,18次测试的平均反应时间总RSD小于8%,供试品细菌内毒素含量回收率为76.66%~149.65%;使用不同厂家鲎试剂时,供试品细菌内毒素含量回收率为76.66%~112.68%。结论:动态浊度法可用于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗及其中间产品中细菌内毒素的定量检测。

篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒工艺的建立

目的建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺。方法对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析并确定脊髓灰质炎病毒的最适培养工艺参数。结果载体装量400~600 g,细胞接种密度1×10^6个/mL时,葡萄糖消耗量最大,平台期持续2~3 d,此时细胞接种病毒最佳。以0. 01~0. 3 MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,采用199培养基于(33±0. 5)℃,pH 7. 4~7. 6条件下培养时,病毒滴度最高,HCP残留量较低,为最适培养工艺。结论初步建立了基于篮式生物反应器的脊髓灰质炎病毒高效制备工艺。

Capto Core 400和Sepharose 6FF在Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化工艺中的应用比较

目的:分别用新型复合型层析介质Capto Core 400和传统介质Sepharose 6FF纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒(Sabin strain poliovirus,sPV)去除宿主细胞蛋白(hostcell protein,HCP)和DNA,并且比较纯化结果及工艺参数。方法:用Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Vero细胞培养的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV浓缩液。分别检测纯化后sPV的D抗原含量、HCP残留量和DNA残留量,计算D抗原回收率、HCP和DNA去除率,并用t检验分析差异。结果:Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV的D抗原回收率差异均无统计学意义(t值分别为1.09、1.08、1.02,P值均>0.05),但前者的Vero细胞HCP(t值分别为3.15、3.23、3.54)和DNA去除率均高于后者(t值分别为3.41、3.25、3.62),且差异有统计学意义(P值均<0.05)。Capto Core 400与Sepharose 6FF的介质使用体积比值为0.05,上样后纯化时间比值为0.04,工作缓冲液使用量比值为0.25,工艺线性流速比值为10,每升介质上样量比值为20,最大耐压力比值为2。结论:对比Sepharose 6FF,Capto Core 400可以更有效地去除Vero细胞HCP与DNA,各个工艺参数得到了优化,提高了sPV层析纯化的工作效率,并节约了时间和成本。

脊髓灰质炎病毒Sabin株减毒的遗传学基础的研究进展

用Ｓａｂｉｎ株生产的口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（ＯＰＶ）由１、２、３型组成，疫苗株是由强毒株经连续传代突变而来，对每种疫苗株而言只有少数位点与减毒有关，特别是５′端非编码区的第５个茎环结构。现已证实Ｓａｂｉｎ株病毒在人体中复制时由于病毒的回复突变或第２位点的抑制突变导致毒力回升，可能在疫苗接种者和接触者中引发脊髓灰质炎病例。用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析（ＭＡＰＲＥＣ）对疫苗中的痕量回复突变进行定量分析已成为可能，正逐步用于从分子水平监测ＯＰＶ生产的连续性，成为评价３型ＯＰＶ质量的一个重要指标。

抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制

目的应用杂交瘤技术制备抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的单克隆抗体。方法用脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原免疫雌性Balbc小鼠,取其致敏脾脏淋巴细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞融合。间接ELISA法筛选阳性克隆,制备腹水。检测McAb效价、抗体亚类和杂交瘤细胞核型。结果获得4株阳性杂瘤细胞株,选择一株制备腹水,ELISA效价为1∶2.4×106,中和试验效价1∶1.3×104,蛋白浓度为27.2mgmL。McAb与Ⅱ型Sabin株C抗原(ⅡC)、Ⅰ型Sabin株及Ⅲ型Phizer株D抗原(ⅠD、ⅢD)不发生交叉反应,具有高度特异性。结论成功的制备了针对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的McAb,为进一步研究IPV效力检测奠定了基础。

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。

中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎病毒疫苗株VP1区基因变异的研究

为研究中国急性弛缓性麻痹 (AFP)病例中脊髓灰质炎 (简称脊灰 )病毒分离株的分子特征 ,为中国继续维持“无脊灰野毒状态”提供理论依据 ,对 2 0 0 2年所有省级疾病预防控制中心送检的脊灰分离株 ,用PCR RFLP法及ELISA法进行型内鉴定。用PCR RFLP法筛查出与疫苗株相比有异常酶切图谱的毒株共 2 4株 ,其中Ⅰ型毒株 1株 ,Ⅱ型毒株 2 1株 ,Ⅲ型毒株 2株 ;用ELISA法筛查出与疫苗株相比有不同的抗原抗体反应的毒株共 2 2株 ,其中Ⅰ型毒株 7株 ,Ⅱ型毒株 4株 ,Ⅲ型毒株 1 1株 ,在 7株Ⅰ型毒株中有 3株为非疫苗类似株 (NSL) ,其余为双反应毒株 (DRV)。随后对这 4 6株毒株进行了全VP1区的基因序列分析。结果表明 :2 0 0 2年脊灰分离株都是疫苗株或疫苗衍生株 ,没有发现野毒株 ,中国继续保持着“无脊灰野毒状态” ;口服减毒活疫苗 (OPV)株与其它野毒株在稳定性性质方面是类似的 ,即通常是不稳定的 ,在人体肠道内有很强的选择性 ;在人体肠道内 ,病毒复制产生的基因变异导致毒力升高 ,是引起疫苗相关麻痹病例 (VAPP)的重要原因 ,但宿主本身的因素也有很大的作用 ;在局部地区有疫苗株的循环或脊灰疫苗衍生株 (VDPV)的存在 ;最终消除疫苗株引起的AFP病例可能还需要脊灰灭活疫苗(IPV)的介入。

PCR方法检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型野毒株的研究

用聚合酶链反应试验（ＰＣＲ）检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（ＰＶＩ）野毒株，仅需５μｌＰＶＩ细胞培养液，方法简便、快速、敏感、特异，用本法对我国１４个省市７９份ＰＶＩ分离株的检测结果，能与检定ｓａｂｉｎⅠ相关株的ＳＩ／ＰＣＲ法的检测结果相印证，与其中３１份核苷酸测序判断为野毒株的结果相一致。其检测阳性率为８４．４％，基本能检测我国流行过的５个ＰＶＩ基因型野毒株。另外，从检测结果看，除北京市未发现野毒株外，其它１３个省区都有野毒株流行，表明当前我国消灭脊灰的任务还很重。

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因特征及其神经毒力的初步观察

中国脊髓灰质炎（脊灰）病毒疫苗株普遍存在基因变异的现象，如重组、点突变等〔１〕。我们选出１０株有代表性的变异株，在具有人脊灰病毒受体基因的转基因小鼠ＰＶＲ－Ｔｇ２１〔２〕中做毒力分析，发现Ｓａｂｉｎ１基因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）的重组株显示很强的神经毒力，其ＰＤ５０ｉｎＴＣＩＤ５０（简称ＰＤ５０）值为４．５，而Ｓａｂｉｎ１标准株的ＰＤ５０值大于８．０。另外两株Ⅰ型疫苗株只在关键性核苷酸位点发生突变，只在位点５２５－Ｕ发生突变的一株，其ＰＤ５０值为５．０，另一株在位点４８０－Ｇ及２７９５－Ａ突变，其ＰＤ５０值为５．８，均显示较强的神经毒力。一株Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与Ｓａｂｉｎ３基因型（３Ｄ）的重组株，其神经毒力（ＰＤ５０≥５．９）亦明显高于Ｓａｂｉｎ２标准株（ＰＤ５０＞７．５）；而１株Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与（Ｓａｂｉｎ１＋Ｓａｂｉｎ２）基因型（３Ｄ）重组株的神经毒力（ＰＤ５０＝７．５０）无明显提高。对Ⅲ型疫苗株的神经毒力分析发现，１株Ｓａｂｉｎ３基因型（ＶＰ１）与Ｎｏｎ－Ｓａｂｉｎ基因型（３Ｄ）重组株的神经毒力，高于仅在核苷酸位点４７２－Ｕ突变的一株疫苗株。值得提出的是，另一株Ⅲ型疫苗?

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗对大鼠的免疫效果

目的比较不同浓度Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin IPV)3针免疫大鼠的中和抗体效价,为确定Sabin IPV的最佳免疫方案提供参考。方法用不同浓度的Sabin IPV对52只Wistar大鼠进行3针免疫,每针间隔1个月,每次免疫后30d采血并分离血清,采用微量中和试验测定血清中抗脊髓灰质炎病毒3个型的中和抗体效价。结果大鼠经3针Sabin IPV免疫后,其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体的几何平均滴度均显著上升,2针免疫后抗体阳转率已经达到100%,且原倍疫苗与稀释疫苗免疫大鼠后,产生的中和抗体水平差异有显著意义。结论Sabin IPV在大鼠中有良好的免疫效果,经3针免疫可产生高水平的中和抗体。

水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选

目的：根据5种细胞系对脊髓灰质炎病毒1型（PV1）5个毒株的敏感性筛选适用于病毒消毒实验的病毒株和细胞系．方法：比较各毒株在不同细胞系中增殖3d～7d后的细胞病变作用（CPE）、半数组织培养感染里（TCⅡ）50）、蚀斑计数（PFU）及免疫印迹（DIBA）试验结果．结果：CPE与TCID）检测表明，同一细胞系Hep2和Hela中病毒感染细胞作用强弱为Henan，Hebei＞Brunhide，Mahony＞Sabin株；不同细胞系对同一病毒株的敏感性为Hep－2＞BGM＞Hela,Vero＞RD细胞．DBA检测提示，Henan株较Brun－hide更易检出．结论：Henan株及Hep－2细胞可作为PV消毒实验所用的病毒和细胞．

四川省脊髓灰质炎Ⅰ型野毒株的分子病毒学检测

１９９１年安岳县和１９９２年会东县各１例临床诊断为脊髓灰质炎（脊灰）的患者，从其粪便标本中各分离出１株病毒，血清学定型均为脊灰Ⅰ型病毒，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ－ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｓｓａｙ）法检测，２株病毒与Ｓａｂｉｎ Ⅰ有明显差异定为Ⅰ型野毒株。又经核酸序列测定，其与Ｓａｂｉｎ Ⅰ型疫苗株亦有明显的差异，证实为脊灰互型野毒株。结果显示，不同年份、不同地方流行株间的序列有差异。四川省脊灰流行与毒株间核酸序列的差异有关，但我国现行疫苗ＯＰＶ（ＯｒａｌＰｏｌｉｏＶａｃｃｉｎｅ）能有效预防我省脊灰，基础兔疫和强化免疫是预防和消灭脊灰的有力武器。

海南省脊髓灰质炎病毒疫苗株分离及相关资料分析

目的 了解海南省 1995～ 2 0 0 0年报告的 15岁以下急性弛缓性麻痹 (AFP)病例及密切接触者粪便标本中脊髓灰质炎病毒 (PV)疫苗株的分离情况 ,分析病例流行病学特征、PV型别分布等相关资料。方法 采用试管法分离肠道病毒 ,微量中和试验法鉴定脊灰病毒 ,国家脊灰实验室采用PCR -RFLP法进行型内鉴别。结果 海南省 1995～ 2 0 0 0年报告的 15岁以下急性弛缓性麻痹 (AFP)病例 177例及 6 85名密切接触者的粪便标本中 ,脊髓灰质炎病毒疫苗株的分离率分别为 10 80 %和 2 .48% ,3岁以内的儿童分别占 94 73%、47 10 %。 19例脊灰病毒疫苗株阳性的AFP病例中 ,31.5 8%的儿童无OPV免疫史 ,2 1.0 5 %的儿童有 1～ 2次免疫史 ,仅 47 37%完成了三次OPV全程免疫。其中 9例病例发病后 6 0天残留麻痹。结论 我国已进入“无脊灰状态” ,已无本土脊灰野病毒感染的病例 ,脊灰病毒疫苗株在人群中的循环及其致病性应进一步研究 ,同时 ,继续保持儿童高的OPV免疫覆盖率仍然是十分必要和有效的。

广东省1997～1999年AFP病例中脊髓灰质炎病毒Ⅱ型疫苗衍生株分子生物学特征及致病性分析

目的 了解广东省 1997～ 1999年急性弛缓性麻痹 (AFP)病例中脊髓灰质炎 (脊灰 )Ⅱ型疫苗衍生株病毒的分子生物学特征及致病性。方法 从脊灰病毒感染的细胞悬液中提取总RNA ,将RT PCR扩增的产物进行RFLP分析及采用Sanger末端双脱氧终止法进行序列测定 ,并结合病例流行病学资料进行分析。结果 1997～ 1999年共从AFP病例中分离到 2 5例脊灰Ⅱ型疫苗株病毒 ,占分离到脊灰病毒病例总数的 37.9% ,其中S2×S3型重组病毒 18例 ,占 72 % ,S2×S1型 1例 ,非重组病毒 6例。S2×S3型重组病毒致残留麻痹 8例 ,占 4 4 .4 %。未服苗儿童感染S2×S3重组病毒致残留麻痹率(6 0 0 % )高于非重组病毒的残留麻痹率 (33 3% )。结论 Ⅱ型疫苗株脊灰病毒普遍存在基因重组现象 ,以S2×S3重组病毒多见 。

脊髓灰质炎病毒减毒株中Ⅲ_2株的性状分析

脊葫灰质炎减毒活疫苗中皿２减毒株是我国已用于人群免疫的疫苗株之一，具有较好的免疫原性及稳定的神经毒力安全性。为探讨中ｍ２株同ｓａｂｉｎ皿型株的相互关系，应用ＲＴ—ＰｃＲ法，克隆了中Ⅲ２株７９４个核苦酸序列。通过核苦酸序列分析、体外特征实验、猴体神经毒力实验发现，中Ⅲ２：株同Ｓａｂｉｎ皿型在核苦酸序列上存在差异。同时，中Ⅲ２株的猴体神经毒力明显低于ＳａｂｉｎⅢ型。结果提示，中ｍ２株同ｓａｂｉｎ皿型之间在基因结构及生物学性状上存在差异。