利用甜菜糖蜜生产单细胞蛋白的研究

以甜菜糖蜜作为发酵原料,经过摇瓶发酵培养,筛选得到一株总蛋白得率较高的酿酒酵母R5。通过研究糖蜜最佳稀释浓度、氮源、无机盐对R5增殖培养的效果,并采用响应面法对优选的碳源、氮源和无机盐类的组成含量进行优化;在28℃、180 r/min条件下培养48 h,菌体总蛋白得率可达到5.528 g/L。

不同菌龄酿酒酵母细胞壁蛋白差异性分析

以酿酒酵母为研究对象,比较了完整细胞提取法、稀碱缓冲液提取法及溶菌酶和β-葡聚糖酶复合酶法等三种酵母菌细胞壁蛋白提取方法,分析了不同菌龄酵母细胞壁差异性蛋白。结果表明:溶菌酶和β-葡聚糖酶复合酶液水解纯化好细胞壁提取蛋白的方法具有所得胞壁蛋白条带较多,且纯度较高的优点,确定了此方法为提取酵母细胞壁蛋白的最佳提取方法。同时,通过SDS-PAGE电泳分析发现,不同菌龄酵母细胞壁蛋白存在着较大的差异性,并确定了分子质量在36 ku、17 ku和12 ku为不同酵母代数细胞壁的3个主要差异性蛋白,其中36 ku、17 ku处条带蛋白随着菌龄的增加酵母细胞壁蛋白表达量逐渐减少,而12 ku处条带蛋白随着菌龄的增加酵母细胞壁蛋白表达量逐渐增加。

适于双向电泳分析的酵母胞外蛋白提取方法

采用了无蛋白酵母培养基培养FFC2144酵母细胞,用硫铵沉淀法、超滤法、冻干酚提等方法提取酵母胞外蛋白,计算3种方法的提取率并分别用双向电泳的方法对提取到的蛋白样品进行分离,同时运用质谱鉴定分离后蛋白。其中冻干-平衡酚法提取后得到114个蛋白点,提取率为73.67%,图谱识别的蛋白点最多图谱最清晰,是研究分泌类蛋白质组学理想的分离方法。

茅台高温发酵应激反应活性酵母衍生物中的蛋白解析

建立酵母细胞应激高温和酒精共同刺激的茅台酒高温发酵工艺实验模型,采用双向电泳方法分析茅台酒高温发酵工艺对酵母细胞活性衍生物(LYCD)中应激蛋白的影响,采用银染显色扫描胶图后用Image Master 2D Platinum5.0凝胶电泳分析软件对胶图分析,检出了23个差异蛋白点。质谱鉴定得到3个重要蛋白,为探讨茅台酒高温发酵工艺的发酵机理提供了依据。

酿酒酵母蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立

利用双向电泳技术分离酿酒酵母全蛋白质,并比较了不同样品制备方法、不同凝胶参数,以及不同染色方法对电泳结果的影响。经过各个环节的条件优化,最终获得了无明显横纵条纹,背景清晰,分辨率较高,重复性较好的酿酒酵母全蛋白质双向电泳图谱。经PD-Quest软件分析,所得图谱约分离到1 000个蛋白质点,该双向电泳图谱的构建为后续氮代谢研究奠定了基础。

酿酒酵母全蛋白的提取

酿酒酵母全蛋白制备方法多样,破碎细胞和制备温度等操作条件差异很大,有必要进行综合比较和量化分析,从而有利于选择适于双向电泳的最优制备方法。文中以蛋白释放率、全蛋白浓度为指标,对制备酿酒酵母全蛋白的常用方法进行了比较分析。在文献报道的玻璃珠破碎制备全蛋白方法的基础上,采用单因素和正交试验设计对破碎次数、玻璃珠用量、装液比等进行了优化,得到了制备酿酒酵母提取全蛋白的最佳条件,蛋白释放率达到了9.23%,蛋白质量浓度为1.21 g/L,较优化前的方法分别提高了0.46倍和0.32倍。通过蛋白质双向电泳进行验证,优化后的电泳图像低丰度蛋白分辨率高,总蛋白点个数由124个增加到181个,35 kDa以下的低丰度蛋白的数量提高了1倍。结果表明,该制备方法可以很好地满足酿酒酵母蛋白质组学研究要求。

不同温度培养下酿酒酵母细胞壁蛋白质差异分析

生物体在其生长过程中要经受一系列非生物环境的胁迫,这些胁迫条件都将影响细胞的基因转录、蛋白质表达物等一系列的变化,以尽快适应周围变化的环境。利用双向电泳和质谱技术考察了高温胁迫对酿酒酵母细胞壁蛋白质组的影响。结果表明,高温胁迫的酿酒酵母FFC2146细胞壁蛋白质中新增Ssa2和小分子鸟苷三磷酸酶,无机焦磷酸酶上调表达,而丙酮酸激酶缺消失,同时6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶下调表达。上述结果说明热休克蛋白Ssa2保护细胞壁在高温下保持完整,使细胞继续生长繁殖;高温胁迫下酿酒酵母的糖酵解途径受阻,在转酮醇酶的作用下糖酵解途径转向磷酸戊糖途径途径,获取足够的能量,维持细胞正常的新陈代谢。

二维电泳技术对脉冲电场处理哈密瓜汁中酿酒酵母的蛋白质组学研究

采用二维电泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术对脉冲电场(pulsed electric field,PEF)处理前后哈密瓜汁中酿酒酵母蛋白质进行检测分析,探究处理过程对酿酒酵母蛋白表达的影响。实验结果得知,所有检测出的酵母蛋白等电点均介于4.00与6.87之间,分子量分布在14.58~109.83 k Da之间;PEF处理后的酿酒酵母为免受环境变化带来的氧化损伤,细胞中硫氧还蛋白过氧化物酶、延长因子2表达上调;并且因场强影响到了细胞的遗传物质,核染色质蛋白和DNA修复蛋白表达上调;此外,细胞中Cu-Zn辅基超氧化物歧化酶和与糖原合成与代谢密切相关的磷酸丙酮酸水合酶的表达下调,反映细胞的活力下降或死亡;与细胞生存和增殖相关蛋白的表达也发生了明显的变化,如胱硫醚β-合酶、腺苷5-单磷酰胺酶、非典型蛋白Ynr034w-A亚基等。PEF处理影响到细胞代谢的相关酶类和遗传物质,可为研究PEF强化杀菌方法提供理论依据。

不同传代次数的酿酒酵母细胞壁蛋白组学分析

【目的】探讨酿酒酵母衰老过程中细胞壁蛋白变化,从蛋白水平上解释酿酒酵母衰老的原因。【方法】以酿酒酵母FFC2146为研究对象,采用显微镜观察法比较了经2、10、15次连续传代酿酒酵母的细胞形态;用计算细胞沉降速率的方法考查酵母凝絮性;通过3,5-二硝基水杨酸法测定降糖速率来表征酵母代谢活力;采用二硫苏糖醇溶解法结合苯酚萃取法抽提不同传代次数的酿酒酵母细胞壁蛋白;并且通过双向电泳进行差异性分析。【结果】结果显示随着传代次数的增加酿酒细胞个体表面变得粗糙,凝絮能力明显增强,降糖能力明显减弱,表明多次传代后的酵母体现出衰老现象。双向电泳结果共得到309个胞壁蛋白点,其中11个蛋白质点存在明显差异。6个蛋白质点在第15代丰度小于第2代丰度2倍以上,4个蛋白质点只在第15代酵母细胞壁中出现,1个蛋白质点只在第2代酵母细胞壁中出现。【结论】酿酒酵母FFC2146经过15次连续传代培养后11个细胞壁蛋白丰度发生明显变化,此11个细胞壁蛋白的表达水平与酿酒酵母衰老相关。

酿酒酵母FFC2146胞内蛋白及胞外蛋白双向电泳条件优化及图谱建立

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的培养基、培养条件及蛋白质提取方案的优化,建立了酿酒酵母胞外和胞内蛋白双向电泳图谱制作方法。在YNB培养基中培养20 h,经过离心取上清-超滤-冻干可得到酿酒酵母胞外蛋白质样品;用SDS缓冲液悬浮酵母细胞-煮沸-超声-增溶,得到了酿酒酵母胞内蛋白质样品。经过双向电泳分离、硝酸银染色和PDQuest图像分析可以检测到了200多种酿酒酵母胞外蛋白和500多种酿酒酵母胞内蛋白。