敲除sfa1基因提高酿酒酵母乙醇合成能力的研究

sfa1基因编码的酶具有乙醇脱氢酶和甲醛脱氢酶双功能活性,通过设计含有与sfa1基因两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6和pUG66为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的酿酒酵母sfa1基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS1并将质粒pSH47转入阳性克隆子,诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得sfa1基因缺陷型酵母突变株YS1-sfa1。摇瓶发酵实验表明,突变株YS1-sfa1的乙醇分解代谢活性降低,乙醇产量提高8.0%。

以PCR为基础的基因破坏技术在酿酒酵母中的应用

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种已知全序列的重要模式生物,具备单双倍体特性、乙醇耐受性强、高效体内重组的能力、可操作性强等优点。同时酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物,各种遗传操作技术业已成熟,因此它在基因操作和生物能源方面是首选的研究对象。以PCR为基础的基因破坏方法第一次在酿酒酵母中被报道后,其方法和技术得到了迅速的改进和发展,目前在酵母中已经广泛应用。文章主要介绍这种方法在酿酒酵母中应用的基本原理和研究方法,以及与其他传统基因破坏方法相比较的优缺点、存在的问题等。说明以PCR为基础的基因破坏方法能够避免繁琐的基因克隆操作,省时、省力、方便。

酿酒酵母ADH3基因的敲除

设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母YS3(Saccharomyces cerevisiae),并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中,阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流,同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Δadh2为出发菌株,应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件,转化酿酒酵母YS2-Δadh2敲除ald6基因,之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中,半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记,最后,传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因,最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Δald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比,突变株乙酸合成量降低18%,乙醇最高产量提高12.5%。