^(60)Co-NTG复合诱变选育丁烯基多杀菌素高产菌株及其杀虫活性

为获得稳定高产的丁烯基多杀菌素生产菌株并明确其对农业害虫的杀灭效果,以前期研究获得的须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona ASAGF19为初始菌株,通过^(60)Co-γ射线和亚硝基胍复合诱变得到1株遗传性状稳定的高产突变株ASAGF30A11,较初始菌株产量提高了61.26%,3次传代产量变化幅度小于10.00%。对高产菌株发酵液进行分离纯化获得了丁烯基多杀菌素粗品,配制成1.5 g/L浓度的母液进行稀释,对蓟马、蚜虫以及小菜蛾进行室内毒力测定,得出其对3种供试害虫的LC_(50)分别为1.92 mg/L、1.23 mg/L和0.27 mg/L。经过比较,丁烯基多杀菌素对蓟马的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为0.57 mg/L)和乙基多杀菌素(LC_(50)为0.64 mg/L);对蚜虫的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为72.60 mg/L),低于阿维菌素(LC_(50)为0.14 mg/L);对小菜蛾的杀灭效果优于多杀菌素(LC_(50)为2.87 mg/L),低于乙基多杀菌素(LC_(50)为0.05 mg/L)。本研究首次探索了^(60)Co-γ射线和亚硝基胍复合诱变对须糖多孢菌的影响,并获得了丁烯基多杀菌素对3种农业害虫的防效,为新型生物杀虫剂对农业害虫的防治提供了一些理论依据。

丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选

为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。

PadR对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及转运相关蛋白表达的影响

为研究padR基因表达对须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)次级代谢产物生物合成及相关蛋白表达的影响,在对须糖多孢菌基因组测序结果的基础上,从基因组中克隆了padR基因上、下游同源臂,利用融合PCR将硫链丝菌素抗性基因插入上、下游同源臂之间,将融合片段与穿梭载体pOJ260连接,构建敲除载体pOJ260-UHA-tsr-DHA。通过接合转移将其导入野生型须糖多孢菌中,通过同源臂双交换获得须糖多孢菌敲除菌株S.pogona-ΔpadR。经HPLC检测分析,敲除菌株次级代谢产物丁烯基多杀菌素产量与原始菌株相比提高了27.3%,且有7个转运相关蛋白出现表达上调。这一研究表明padR基因的敲除能够有效促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成。该研究对优化须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成途径具有一定的指导意义,为研究padR基因表达在链霉菌次级代谢产物合成中的作用打下了基础。

不同碳源对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成的影响

本文研究了不同碳源对须糖多孢菌生长以及丁烯基多杀菌素生物合成的影响,通过寻找优势碳源优化发酵培养基配方,促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成。试验共设11个处理,1个对照,通过单因素试验比较不同处理组菌体OD600值和丁烯基多杀菌素产量,筛选获得最优碳源及其发酵培养基配方。结果表明,除可溶性淀粉和木糖外,须糖多孢菌在9种碳源中都能进行生长,对不同构型碳源显示较好的利用率。在以半乳糖、葡萄糖、果糖和甘露糖作为碳源时具有较好的生长速率,而以甘露糖为碳源时能显著促进丁烯基多杀菌素的合成。选择甘露糖最佳添加浓度为5 g/L,须糖多孢菌最高菌体浓度和丁烯基多杀菌素产量分别是初始配方条件的1. 32倍和1. 78倍,显著提高了丁烯基多杀菌素的产量。上述结果为培养基碳源对丁烯基多杀菌素生物合成影响机制的研究及丁烯基多杀菌素大规模工业化发酵生产提供了科学依据和新的技术途径。

丁烯基多杀菌素高产菌株的选育和改造策略

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是一种由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生的杀虫剂,兼具生物农药的安全性和化学农药的速效性。当前,野生型须糖多孢菌合成丁烯基多杀菌素效率低,达不到工业生产要求,获得高产菌株是亟待解决的问题。目前关于丁烯基多杀菌素的相关研究较少,由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的多杀菌素是丁烯基多杀菌素的结构类似物,具有相似的生物合成途径,本文介绍了两者的基本特性,借鉴多杀菌素的研究经验总结了丁烯基多杀菌素高产菌株已有及可用的选育和改造策略,包括传统的理化诱变方法以及代谢流调控、途径基因调控、转录调控、异源表达等更加精准的基因工程方法,以期为后续丁烯基多杀菌素的深入研究提供思路。

基于代谢路径优化提升丁烯基多杀菌素产量的研究进展

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是一种由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生的大环内酯类抗生素,属于绿色环保型生物农药,在防治害虫和粮食储藏方面具有很高的应用价值。野生型菌株产量较低,限制了丁烯基多杀菌素的应用,高产菌株的育种和发酵工艺优化是提升丁烯基多杀菌素产量的有效方法。对近年来遗传育种提高丁烯基多杀菌素的方法进行总结,分析须糖多孢菌的碳、氮、磷酸盐代谢通路改造及转录调控对丁烯基多杀菌产量的影响,展望异源表达进行菌株育种的前景,以期对丁烯基多杀菌素高产菌株的构建和优化提供有价值的参考。

新型生物农药-丁烯基多杀菌素

丁烯基多杀菌素是由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生的一类大环内酯类抗生素,对多杀菌素难于控制的世界性检疫性害虫苹果蠹蛾和重要农业害虫烟青虫具有良好的生物防治作用。丁烯基多杀菌素与多杀菌素生物合成的主要区别在于busA比spnA多5 244 bp,该序列编码5个功能结构域,负责在C21上合成丁烯基替代多杀菌素相应位置上的乙基。综述了丁烯基多杀菌素的结构和理化性质、产生菌的生物学特性、生物合成过程及相关基因和酶、杀虫谱、提取等有关研究进展。

fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响

fcl基因编码的GDP-岩藻糖合成酶(GDP fucose synthetase,GFS),能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-岩藻糖过程中的两步差向异构酶和还原酶反应;还参与氨基糖和核糖的生物合成,是调控生物体糖代谢、核苷酸代谢的关键酶之一。通过前期基因组测序表明须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona中存在fcl基因。利用基因工程技术构建了fcl基因的过表达菌株S. pogona-fcl和敲除菌株S. pogona-Δfcl。结果表明该基因对菌株生长发育、蛋白表达及其转录水平、杀虫活性、丁烯基多杀菌素的生物合成均存在影响。经HPLC分析显示,S. pogona-Δfcl的丁烯基多杀菌素产量增加为野生型菌株的130%,S.pogona-fcl的丁烯基多杀菌素产量降低了25%。生测结果显示,与野生型菌株相比S.pogona-Δfcl对棉铃虫的杀虫活性明显增强,而S.pogona-fcl的杀虫活性降低。利用扫描电镜观察发现,S. pogona-Δfcl菌丝体表面出现褶皱,呈现短棒状,S. pogona-fcl菌丝形态与野生型菌株一致。以上结果表明,fcl基因的敲除影响菌丝体的生长发育,能促进丁烯基多杀菌素的生物合成和增强杀虫活性,该基因的过表达抑制了丁烯基多杀菌素的生物合成和降低了杀虫活性。SDS-PAGE结果表明,三株菌株在96 h时蛋白表达差异最为明显。对差异蛋白通过实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,三菌株蛋白的转录水平存在显著表达差异。通过研究结果构建了网络代谢调控图,分析fcl基因对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成代谢调控网络途径的影响,初步构建了fcl基因调控的代谢途径,为揭示丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制及相关后续研究提供了实验依据。

LytSR和PdtaSR双组分系统对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响

【目的】须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)基因组中存在一些双组分系统(two-component system,TCS),包括一个LytR调控因子和一个PdtaR转录抗终止调节因子,我们旨在通过基因工程技术改造分析这两个双组分系统蛋白在须糖多孢菌中的作用。【方法】本研究利用融合PCR和属间接合转移技术,构建了S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR工程菌株,研究它们对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响。【结果】HPLC检测和质谱鉴定表明,与原始菌相比,S. pogona-?lytR中丁烯基多杀菌素产量有所提高,而S. pogona-PdtaR中产量下调,表明lytR和pdtaR对丁烯基多杀菌素生物合成有负调控作用。此外,生长曲线测定和表型分析结果表明,S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR对须糖多孢菌的生长发育和孢子形成也产生了一定的影响。【结论】本研究为进一步阐明丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制奠定了理论基础。