弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论 GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达

为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的克隆与序列分析

根据已发表的柔嫩艾美耳球虫(Houghton株)基因序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,将扩增的片段连入pMD18T载体,筛选阳性克隆进行测序和序列分析。结果表明,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,测得ORF全长813bp;与GenBank中收录的Houghton株柔嫩艾美耳球虫的SAG2基因序列相比,有4个碱基发生变异,两者的核苷酸序列同源性为99.50%;柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的推导氨基酸序列同源性为99.63%,其中,A185G变异导致了编码氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸(E62G),A247T变异导致了编码氨基酸由蛋氨酸变为亮氨酸(M83L),而其他核苷酸的突变为无义突变;SAG2抗原的N端和C端疏水性较强,并且N端前23个氨基酸为跨膜信号肽区,而中间有许多亲水性区域,且显示很强的抗原性。柔嫩艾美耳球虫长春株与Houghton株的SAG2基因编码蛋白相似性很高,具有很强的抗原性,可以作为球虫疫苗的候选抗原来进一步研究。

SAG2基因片段的体外扩增及在孕妇弓形虫感染诊断中的应用

目的 根据弓形虫表面抗原SAG2基因序列 ,设计弓形虫特异性引物一对 ,采用聚合酶链反应技术 ,进行弓形虫感染的检测。结果 从弓形虫DNA提取物中扩增出 5 93bp的基因片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ;与弓形虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、间日疟原虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带 ;该检测体系至少可检测出相当于每 μl血样中 2个弓形虫的水平 ;将该检测体系用于临床孕妇产前诊断 ,5 6份标本中检查出 3例。结论 所建立弓形虫PCR检测体系灵敏、特异 ,适用于孕妇弓形虫感染的诊断。

弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析

构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。

蜥蜴利什曼原虫表达柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的保护效果检测

本试验将已构建的PLEXSY-neo2-SAG2在蜥蜴利什曼原虫中表达,以皮下注射的方式免疫雏鸡,经检测各组体液和细胞免疫水平、OPG、相对增重率及ACI等指标,对重组蛋白的抗球虫保护效果做出评价,为制备相关疫苗的研究奠定基础。

云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的SAG2基因位点分析

目的初步了解云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型特征。方法使用基因提取试剂盒提取龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因,运用巢式PCR技术分别对弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)进行扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪下观察结果。用DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并进行酶切,酶切产物置于37℃恒温培养箱孵育16h,孵育后的酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像观察结果并与弓形虫基因Ⅰ型标准株进行对比鉴定。结果 112份HIV阳性者全血37份扩增出弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)。从37份弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)扩增阳性的全血标本中选择条带较亮的6份进行酶切,并与弓形虫基因I型标准株比对,初步确定2号标本为基因Ⅲ型,其他标本为基因Ⅰ型。从酶切的6份标本中选择2份进行测序,其中1份为酶切Ⅲ型(测序的2号标本)。经过基因序列对比分析,各弓形虫株之间SAG2基因的碱基对差异较小。其中基因Ⅰ型36份,Ⅲ型1份。结论初步确定云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型以Ⅰ型为主,Ⅲ型少见,未见Ⅱ型及其他基因型。

云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫SAGSAG2基因位点分析

目的初步了解云南临沧HIV阳性者血液中弓形虫的基因型特征。方法运用巢式PCR法对弓形虫SAG2基因的两个片段分别进行基因提取、扩增,然后对PCR产物进行回收纯化、酶切及测序,并与弓形虫基因I型标准株进行对比鉴定。结果从170份HIV阳性者全血样本中分别扩增出35个弓形虫SAG2基因(241、221 bp),从其中扩增阳性的全血样本中各选择4份分别进行酶切,扩增出目的基因片段,进一步从酶切样本中选择2份与弓形虫基因标准株RH株进行对比,酶切SAG2基因(241 bp)显示血液样本基因型为Ⅰ型或Ⅱ型,酶切SAG2基因(221 bp)确定基因型均为Ⅰ型。结论初步确定云南临沧HIV阳性者弓形虫基因型以Ⅰ型为主。

柔嫩艾美尔球虫SAG_2基因重组卡介苗的抗球虫保护效果

本研究旨在通过动物试验,按设计以滴鼻、口服和颈部皮下注射的方式,将已构建的含有柔嫩艾美尔球虫SAG_2基因的卡介苗pMV361-SAG_2免疫雏鸡,通过检测鸡体液及细胞免疫水平、卵囊数、相对增重率、抗球虫指数等指标,对所构建的重组卡介苗的保护效果进行综合评价。结果显示,在实验室条件下重组卡介苗pMV361-SAG_2具有增强鸡抵抗柔嫩艾美尔球虫的免疫保护功效,且以滴鼻的方式进行免疫时效果最佳。本研究为抗球虫疫苗的研究提供试验依据。

利用环媒恒温基因扩增法检测生猪刚地弓形虫

基于已公布的刚地弓形虫Sag2基因序列设计了1套特异引物,经过条件优化,成功建立了针对刚地弓形虫(简称弓形虫)的环媒恒温基因扩增检测法.根据扩增弓形虫和其他几种病原生物的效果对该方法进行评估.结果表明,该方法只检出致病性弓形虫,特异性良好;检测最低速殖子浓度为4个/μL.对长沙、株洲、湘潭三地生猪血样检测的结果是仔猪、成猪和种母猪弓形虫感染率分别为6.45%、7.69%和15.38%.

巢式PCR法检测弓形虫的应用研究

目的调查山东省商品肉弓形虫污染和动物弓形虫感染情况,并进行SAG2分型研究,分析商业肉制品在弓形虫传播中的作用。方法自由市场采集商品肉,用巢式PCR方法检测弓形虫DNA,阳性者经纯化PCR产物,进行SAG2临床分型研究。结果共检测商品肉89份,阳性22份,阳性率为24·72%。其中,猪肉标本56份,16份阳性,阳性率为28·57%,Ⅰ型13份,Ⅱ型1份,Ⅱ型与Ⅰ型混合感染1份,未能定型1份;羊肉标本33份,6份阳性,阳性率为18·18%,Ⅰ型5份,Ⅱ型与Ⅰ型混合感染1份。22份阳性标本中单纯Ⅰ型占81·82%,Ⅱ型与Ⅰ型混合感染占9·09%,Ⅲ型未能检测到。1份可疑病人血标本阳性,为Ⅰ型。结论肉类弓形虫污染率很高,以Ⅰ型为主,是人类感染的重要来源。家庭食品加工过程中生熟不分与人们对食品鲜美的追求造成误食包囊感染,可能是造成人类弓形虫感染率大幅升高的最为重要的原因之一。