鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。

减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

应用自杀性质粒载体构建鼠伤寒沙门氏菌Pla基因的位点专一性突变

带有ｐＳＶ１质粒的ＳＭ１０λπ寄主菌，由于ＳＭ１０λπ染色体上带有ＲＰ４的诱动性基因和促进Ｒ６Ｋ复制起点启动复制的π基因，故ｐＳＶ１质粒能够复制且可被诱动。被研究的鼠伤寒沙门氏菌ｐｒｔＡ基因，经人工拼接Ｋｍ抗性基因的插入钝化后，连接到ｐＳＶ１质粒上，所构建的质粒就可被诱动到鼠伤寒沙门氏菌体内。由于在新的寄主菌内缺乏π基因，ｐＳＶ１的Ｒ６Ｋ复制起点缺少π蛋白的帮助无法进行自我复制，表现出自杀性质粒的功能，而其上被Ｋｍ基因插入的ｐｒｔＡ势必与染色体上同源的ｐｒｔＡ进行交换，使染色体上ｐｒｔＡ基因出现位点特异性诱变。经测定原始从发菌株，诱变菌株的ｐｌａ功能后，证实后者功能被人工地失活，说明ｐｒｔＡ基因具有编码ｐｌａ的功能。本方法的建立将为革兰氏阴性杆菌染色体上任何基因的研究找到一条简便有效的途径。

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌sseK2基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的检测sseK2基因的缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,为探究该基因的功能及开发安全有效的鼠伤寒沙门菌活疫苗提供新思路。方法首先通过重组自杀性质粒介导,两步筛选法敲除1 047 bp sseK2基因并成功构建缺失株及其回复株,进而检测其生物学和免疫学特性。结果PCR、双酶切及测序结果分析,证实构建了SL1344△sseK2缺失株及其回复株。生物学特性研究表明,缺失株SL1344△sseK2保留了亲本株SL1344的血清型1,4,[5],12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK2基因,生化特性和生长速度并未发生明显改变,但与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变。缺失株SL1344△sseK2口服感染6周龄BALB/c小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)为3.44×10^8菌落形成单位(colony-forming units,CFU),毒力较亲本株SL1344降低了1 620倍。免疫保护效力试验显示,缺失株免疫17 d后对鼠伤寒沙门菌野生株攻毒小鼠的保护率为62.5%,小鼠免疫14 d后血清抗体IgG达到最高。回复株与亲本株生物学特性无显著性差异,基本回复到野生型水平。结论成功构建了SL1344△sseK2基因缺失株,其遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,推测sseK2对SL1344的毒力具有重要的调节作用,为探究该基因的功能及评估其作为用于减毒活疫苗的候选株提供参考。