杜仲叶多糖对植物乳杆菌CICC 20022胆盐耐受性的影响

以植物乳杆菌CICC 20022为研究对象,探讨在胆盐胁迫环境中添加杜仲叶多糖对菌株活菌数、微观结构、细胞膜脂肪酸组成、细胞膜和细胞壁结构完整性的影响。结果表明:在胆盐胁迫环境中添加杜仲叶粗多糖或杜仲叶精多糖并培养24 h时,植物乳杆菌CICC 20022的活菌数显著增加(P<0.05),分别是对照组的1.30倍或1.10倍;与对照组相比,添加杜仲叶粗多糖或杜仲叶精多糖均可较好地保护菌体的微观结构,显著减少因胆盐胁迫造成的菌体损伤,且菌体的PI荧光强度、碱性磷酸酶(AKP)活性和DNA渗漏量均显著降低(P<0.05),细胞膜中不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸的比例(U/S)显著增加(P<0.05),达0.37。因此,在胆盐胁迫环境中添加杜仲叶多糖能较好地保持植物乳杆菌CICC 20022细胞结构的完整性,并提高其胆盐耐受性。

不同炮制温度对盐杜仲主要有效成分含量的影响

比较盐杜仲不同温度下炮制前后主要化学成分松脂醇二葡萄糖苷的变化,推测其适宜炮制温度并优化炮制工艺参数。依据《中华人民共和国药典》(2020年版)中的“断丝”指标,考察不同炮制温度对杜仲“断丝”程度的影响,优化杜仲炮制工艺参数。采用高效液相色谱(HPLC)分析杜仲生品和盐炙品主要化学成分的差异,研究炮制工艺对杜仲质量的影响。结合实验数据确定杜仲炮制温度为110℃,时间控制在8 min左右。高温炮制后杜仲化学成分含量明显降低,其主要有效成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG)也大幅减少。采用HPLC方法,分析炮制前后杜仲主要化学成分的变化,为杜仲盐炙工艺和盐杜仲的质量控制提供了更可行的参数依据。

盐杜仲饮片质量标准研究

目的:制定盐杜仲饮片的质量标准。方法:分别测定盐杜仲饮片水分、总灰分及醇溶性浸出物,对薄层色谱法及HPLC色谱法进行研究。结果:得到不同产地13批次盐杜仲饮片的水分、总灰分和醇溶性浸出物测定。结果:同时确定了薄层鉴别和HPLC含量测定的方法。结论:制定了盐杜仲饮片的质量控制标准。

盐炙对杜仲中京尼平苷酸体内药代动力学的影响

目的建立测定大鼠血浆中京尼平苷酸的UHPLC-MS/MS方法,研究盐炙对杜仲中京尼平苷酸药代动力学的影响。方法色谱柱:BEH-C18(100mm×2.1mm,1.7μm);流动相:0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱;流速:0.3mL/min。结果京尼平苷酸在生品和盐炙品组大鼠体内的药动学参数分别为:AUC(0-t)(1 547.18±272.28)、(2 120.694±664.532)ng·h/mL;AUC(0-∞)(1 564.42±273.97)、(2 145.61±659.983)ng·h/mL;Cmax(517.59±51.24)、(733.292±261.34)ng/mL;MRT(2.68±0.11)、(2.551±0.08)h;T1/2(1.37±0.08)、(1.43±0.17)h;Tmax(1.52±0.1)、(1.51±0.1)h。结论杜仲盐炙后有助于促进京尼平苷酸的吸收,一定程度上增加了其生物利用度。

盐胁迫对杜仲幼苗生理特性的影响

通过研究杜仲幼苗对盐胁迫的生理响应,探讨杜仲耐盐机理,以选育出较耐盐的杜仲品种。结果表明,叶片盐害在胁迫浓度和持续时间上,响应的速率和受害症状持续增大;质膜透性、叶绿素含量、SOD活性、脯氨酸含量均随NaCl浓度的增加和处理时间的延长表现出逐渐增加的趋势,低盐度胁迫下增加趋势不明显,中、高盐度胁迫下迅速上升,上升到一定程度后开始下降;不同杜仲品种的抗盐性存在明显的差异,其中JC159和JC009具有较高的抗盐性,JC119和JC144的抗盐性相对较弱。

Box-Behnken响应曲面法优化盐炙杜仲炮制工艺的研究

采用Box-Behnken设计响应曲面法优化盐炙杜仲的最佳炮制工艺。在单因素实验的基础上,以炮制时间、炮制温度、盐加入量为影响因素,以w(松脂醇二葡萄糖苷)为响应值,对杜仲盐炙炮制工艺参数进行优化分析。盐炙杜仲炮制工艺最佳条件为炮制时间20min、炮制温度140℃、每100g杜仲加入盐2.0g,在此条件下,实测值与响应曲面法理论值高度拟合,使用该方法能够合理优化盐炙杜仲的炮制工艺。

培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响

以B5+0.5mg/LNAA+0.5mg/LBA为基本培养基,研究了B5培养基中8种主要无机盐浓度对杜仲愈伤组织生长及绿原酸和总黄酮两种次生代谢产物含量的影响。结果表明:在1000～5000mg/L范围内增加培养基中KNO3的含量有利于愈伤组织生长,B5培养基中当KNO3的浓度达到2/3时,绿原酸和总黄酮含量及产量最高;(NH4)2SO4以4/3原浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高,对绿原酸的含量则是其为原浓度的1/3时最高;MgSO4以2/3浓度对生长量及1/3浓度对绿原酸、总黄酮积累最高;NaH2PO4、CaCl2和MnSO4以原浓度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好;ZnSO4和FeSO4的原浓度愈伤组织的生长量最大,而1/3浓度的绿原酸和总黄酮含量最高。

杜仲盐制前后化学成分的变化

目的比较杜仲盐制前后化学成分的差异,推测其炮制原理。方法采用紫外分光度结合HPLC-UV法比较盐制杜仲前后饮片中总氨基酸、总黄酮、总多糖以及京尼平苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷这4种化学成分含有量的差异。结果与生品相比,杜仲盐制品中总氨基酸的含有量增加了24.232%,总多糖增加了78.169%,总黄酮降低了16.129%,而京尼平苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷这4种化学成分的含有量分别降低了50.663%、21.925%、18.410%、32.923%。结论杜仲盐制的原理可能是增加总氨基酸和总多糖的溶出,或改变各化学成分群的配比关系。

杜仲盐制前后质量变化的比较研究

目的:研究杜仲盐制前后质量的变化。方法:通过杜仲盐制前后松脂醇二葡萄糖苷的含量、醇溶性浸出物以及指纹图谱的变化进行比较研究。结果:杜仲盐制后松脂醇二葡萄糖苷的含量均有不同程度的下降,醇溶性浸出物因产地的不同而呈现出不同的变化趋势,杜仲指纹图谱共标出指纹峰11个,盐杜仲则标示出8个。结论:杜仲经盐制后松脂醇二葡萄糖苷的含量下降,醇溶性浸出物也发生改变,杜仲盐制后HPLC色谱指纹图谱指纹峰减少,且大部分成分含量下降。

不同环境下杜仲胶/丁腈橡胶共混胶的性能

将杜仲胶(EUG)与丁腈橡胶(NBR)共混,研究了共混胶的硫化特性、结晶行为、力学性能以及不同环境下的老化性能。结果表明,当EUG用量为10份(质量,下同)时,EUG/NBR混炼胶的焦烧时间和正硫化时间以及硫化胶的拉伸强度和扯断伸长率均达到最大值。添加一定量的EUG对NBR硫化胶的耐盐雾和耐紫外线性能均能起到一定程度的改善作用,而共混硫化胶的硬度和耐油性能均在EUG用量为20份时体现最佳值。差示扫描量热分析表明,上述现象产生的原因在于共混硫化胶中存在的微晶及EUG与NBR的相容性所致。

盐杜仲标准汤剂制备及指纹图谱研究

目的制备盐杜仲标准汤剂并建立质量标准。方法制备15批盐杜仲标准汤剂,以松脂醇二葡萄糖苷为指标成分,计算出膏率、指标成分含量和转移率,并建立超高效液相色谱指纹图谱分析方法,使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价,采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱技术对共有峰进行结构鉴定。结果15批盐杜仲标准汤剂中松脂醇二葡萄糖苷转移率为42.74%~71.43%,平均为57.26%。15批盐杜仲标准汤剂指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.95。指纹图谱共有峰9个,确认分别为梓醇、杜仲醇苷、京尼平苷酸、车叶草苷酸、绿原酸、olivil-4’-O-β-D-glucopyranoside、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷和紫云英苷。结论本研究建立的盐杜仲标准汤剂制备工艺稳定,指纹图谱方法精密度、稳定性及重复性良好,可为盐杜仲配方颗粒的质量控制提供参考。

盐杜仲配方颗粒的质量标准

目的建立杜仲炮制品盐杜仲配方颗粒的质量标准。方法采用醇溶热浸法测定盐杜仲配方颗粒的浸出物,采用高效液相色谱法对盐杜仲配方颗粒中松脂醇二葡萄糖苷进行含量测定,分别对Agilent 1260系列高效液相色谱仪与Waters高效液相色谱仪和不同品牌色谱柱进行考查,建立盐杜仲配方颗粒指纹图谱。结果松脂醇二葡萄糖苷进样量在102.8~2 056.0 mg·L^(-1)与峰面积呈良好线性关系(R^2=0.999 9),标准曲线为:Y=2.959 4X+3.282 5,平均加样回收率为99.85%(RSD=0.31%,n=9)。结论所采用方法可行,重复性好,可有效控制盐杜仲中药配方颗粒的质量。

杜仲生品及盐炙品HPLC指纹图谱比较研究

目的:比较研究杜仲盐炙前后HPLC指纹图谱的变化规律。方法:采用HPLC法研究杜仲盐炙前后的指纹图谱。色谱柱为SP-120-5-ODS-AP(150mm×4.60mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水线性梯度洗脱,流速为1.0mL.min-1,检测波长为230nm,进样量为5μL,柱温为25℃。结果:杜仲生品指纹图谱中标出共有指纹峰15个,杜仲盐炙品则标示出16个共有峰。结论:杜仲经盐炙后HPLC指纹图谱指纹峰数有所增加,且大部分峰面积亦有增加趋势,可以认为杜仲盐炙后化学成分发生了一定的质变和量变。

杜仲炮制历史沿革及近20年研究进展

对杜仲近20年的炮制工艺进展进行梳理,分析与讨论了杜仲新炮制工艺的发展前景、炮制过程中成分转化规律及不同炮制品药效作用,以期推动杜仲炮制工艺的现代化与智能化发展,更好地服务于中药炮制产业与临床用药。

杜仲半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EuCPI的克隆及功能分析

【目的】以杜仲种仁为试材,克隆EuCPI基因全长序列并分析其结构特征,探究该基因的抗逆功能及对黄粉虫生长发育的影响,为今后深入研究其抗逆机制提供理论基础。【方法】提取杜仲种仁的RNA并反转录成cDNA,采用RACE技术扩增EuCPI基因的全长cDNA序列;利用生物信息学网站对其所编码蛋白的理化性质及结构功能进行分析预测;利用pET28a质粒构建原核表达重组载体,对重组蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot及蛋白纯化试验;利用重组的原核表达系统探究在盐胁迫和高温胁迫下含有EuCPI基因的大肠杆菌和对照组之间生长曲线的不同,初步鉴定该基因对大肠杆菌的影响;此外,利用诱导后的重组菌液饲喂黄粉虫,探究EuCPI基因对黄粉虫生长发育的影响。【结果】EuCPI基因具有547 bp的全长序列(GenBank登录号:MT702592),开放阅读框(ORF)为309 bp,编码蛋白由102个氨基酸组成,理论等电点(pI)为6.41,分子质量为11.17 kDa,不稳定指数为27.73,属于稳定蛋白,总平均亲水性为-0.416,属于亲水蛋白。氨基酸序列分析结果表明,EuCPI蛋白无跨膜结构,无信号肽,主要由50%的α-螺旋、36.27%的无规则卷曲、11.76%的延伸链和1.96%的β-折叠组成,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。系统进化树分析结果表明,该蛋白与欧洲栓皮栎CPI编码蛋白同源性较高。通过构建的原核表达载体pET28a-EuCPI,诱导表达并纯化出15.29 kDa大小的重组蛋白。高温胁迫试验生长曲线结果表明,在37℃条件下前10 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌与对照组长势基本一致,而在42℃和50℃条件下前10 h含有EuCPI基因的菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制情况。固体培养基盐胁迫试验结果表明,随着培养基中NaCl浓度增加,试验组和对照组菌落均出现生长抑制现象,但含有EuCPI基因的菌落数量明显多于对照组,尤其在0.75 mol·L^(-1)时,前者有较多的单菌落存活而后者无单菌落存活;液体培养基盐胁迫试验生长曲线结果表明,在0.25 mol·L^(-1)NaCl浓度条件下,前8 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制现象。饲虫试验结果表明,取食含有EuCPI基因的饲料的黄粉虫体质量呈下降趋势,而对照组体质量呈上升趋势,经数据分析存在极显著差异(P<0.01)。【结论】EuCPI基因能够提高大肠杆菌对高温胁迫和盐胁迫的耐受性,含有EuCPI基因的重组菌对鞘翅目昆虫黄粉虫的生长发育有一定抑制作用。

杜仲饮片去粗皮合理性的探讨

目的探讨不同饮片企业未去粗皮的杜仲饮片性状检验问题。方法靶向性的收集10批样品(包括杜仲饮片与盐杜仲),归纳切制形状的特点,按2015年《中国药典》(一部)检验;并对样品进行5种重金属[铅(Pb)、镉(Cd)、铜(Cu)、砷(As)和汞(Hg)]及有害元素的检测;对Pb元素超出限度的6批样品进行粗皮、去粗皮饮片分析。结果市场流通的饮片按切制形状主要分为4种类型,即竹帘状杜仲饮片、未去粗皮的块片状杜仲饮片,丝条状盐杜仲、未去粗皮的块片状盐杜仲。6批粗皮中重金属Pb元素明显高于相应刮去粗皮饮片的量。结论未去粗皮杜仲饮片未按标准规定在加工时刮去粗皮,而粗皮中Pb元素检测值高,表明杜仲饮片去粗皮具有合理性。

基于HPLC指纹图谱和多成分含量测定结合化学计量学的盐杜仲质量评价研究

建立盐杜仲的HPLC指纹图谱及多成分含量测定方法,结合指纹图谱相似度评价、聚类分析(cluster analysis, CA)、主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least square discriminate analysis, OPLS-DA)进行不同来源盐杜仲的质量评价。采用Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5μm),以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长238 nm,柱温30℃,进样量10μL。20批不同来源盐杜仲的指纹图谱相似度评价结果表明,除S3批次样品指纹图谱相似度为0.893外,其余19批次样品的相似度均≥0.919,表明相似度较好;共标定14个共有峰,并指认了京尼平苷酸等7个共有峰,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、鹅掌楸苷和松脂醇单葡萄糖苷7个成分的质量分数依次为0.062 0%~0.426 9%、0.024 9%~0.116 5%、0.009 5%~0.052 9%、0.005 5%~0.034 8%、0.115 9%~0.317 8%、0.016 4%~0.108 8%、0.026 4%~0.039 8%;通过CA、PCA和OPLS-DA均可将20批盐杜仲划分为3类,且通过OPLS-DA项下的变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)值分析筛选出京尼平苷酸和绿原酸2个差异质量标志物。该研究建立的HPLC指纹图谱和多成分含量测定方法稳定、可靠,可为盐杜仲的质量控制提供参考。

杜仲盐制前后胶丝力度与色度值及特征成分含量的相关性研究

目的分析杜仲盐制前后杜仲胶胶丝力度与色度值及特征成分含量的相关性,为杜仲炮制过程质量控制提供理论依据。方法以盐制前后的杜仲饮片为研究对象,使用Instron3343型材料试验机测定杜仲胶丝力度,利用测色仪采集色度值L、a、b、Eab,采用HPLC法测定京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷6个化学成分的含量,利用变量投影重要性分析(variable importance projection,VIP)与散点图(scatter plot,S-Plot)分析各成分的权重,结合SPSS 26.0与SIMCA 14.1软件分析样品胶丝力度与色度值、特征成分含量间的相关性。结果与生品相比,杜仲盐制后胶丝力度极显著降低,L、a、b、Eab均不同程度降低,金丝桃苷的含量、色度值L、a、b、Eab与胶丝力度均呈显著正相关,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量与胶丝力度均呈显著负相关,松脂醇二葡萄糖苷、京尼平的含量与胶丝力度无明显相关性。结论盐制后杜仲饮片的胶丝力度降低,杜仲饮片的色度值和金丝桃苷含量也一同降低,而京尼平苷酸、绿原酸与京尼平苷的含量反而增加。为盐杜仲饮片的定性判别提供了科学依据,同时为杜仲盐制的质量控制提供了一种新的研究思路和理论基础。

基于液质联用技术结合化学计量法分析杜仲盐制前后差异性成分

目的通过超高液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Triple-TOF-MS)对杜仲盐制前后成分进行鉴定,分析差异性成分。方法利用UPLC-Triple-TOF/MS检测杜仲中的化学成分,液相采用Waters HSS-T3色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.8μm),以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量为0.3 mL/min,柱温为50℃;检测波长254 nm;进样量3µL。质谱采用负离子扫描模式采集数据,根据一级准分子离子与二级碎片离子信息进行化合物的分析与鉴定。通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)对杜仲盐制前后进行差异成分分析。结果共解析出杜仲中52种成分,结合OPLSDA筛选出14个影响杜仲盐制前后质量的潜在差异性成分,分别为京尼平苷、绿原酸、杜仲醇、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、京尼平、eucomoside B、异绿原酸C、teuhircoside硫酸脂、橄榄素二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、中脂素二葡萄糖苷和去氢二松柏醇葡萄糖苷。结论建立了杜仲盐制前后化学成分定性分析方法,筛选出盐制前后杜仲质量变化的潜在差异性成分,为杜仲盐制的增效物质基础的研究提供了科学依据,对杜仲质量控制提供更加全面的支撑。

杜仲盐炙前后主要活性成分在肾纤维化大鼠体内的药代动力学研究

建立杜仲生、盐炙品提取物中6种主要活性成分(桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和松脂醇单葡萄糖苷)在腺嘌呤致肾纤维化模型大鼠血浆中的定量分析方法,并对比研究其体内药代动力学行为。应用UHPLC-Qq Q-MS/MS技术,采用负离子模式进行扫描,以MRM配对离子方式进行定量,同时对其专属性、线性范围、准确度、精密度、稳定性、提取回收率及基质效应进行考察,方法学考察结果均符合生物样本的分析要求。成功建立了一种可同时测定杜仲生、盐炙品提取物中6种活性成分在大鼠血浆中快速、灵敏、准确的定量分析方法,并对肾纤维化大鼠单次给予杜仲生、盐炙品提取物后不同时间点各成分的血药浓度进行检测,计算各成分的药代动力学参数并构建药-时曲线。本实验获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号:202103A008)。结果表明,与杜仲生品组相比,杜仲盐炙品组大鼠血浆中桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和松脂醇单葡萄糖苷等化合物的tmax值均显著小于生品组(P<0.05,P<0.01);绿原酸的Cmax、AUC0-48 h,松脂醇二葡萄糖苷的Cmax、AUC0-48 h和AUC0-∞,京尼平苷以及松脂醇单葡萄糖苷的Cmax均显著高于生品组(P<0.05,P<0.01)。研究发现,相较于杜仲生品,多种活性成分在杜仲盐炙品的给药环境下可发挥速效作用,有更高的血药浓度峰值与生物利用度,进一步验证了“入盐走肾脏”的中医理论,为杜仲生品及其盐炙品质控指标的选择、炮制机制的阐明和体内代谢规律的深入研究提供了实验参考依据。