敲除Sam68基因导致白血病细胞系细胞生长迟缓和G2/M期延长

RNA结合蛋白Sam68是细胞有丝分裂期Src酪氨酸磷酸化的靶蛋白.尽管确切机制尚不清楚,一些人还是认为Sam68可通过调控RNA的代谢参与细胞周期调控.利用基因打靶技术,在DT40细胞分离出Sam68基因缺失的细胞系.利用该细胞系,进行Sam68的功能解析.与野生型细胞系相比,Sam68基因缺失细胞表现出明显的生长速度迟缓.通过细胞周期研究揭示,这些细胞生长速度延迟是由于细胞周期中的G2/M期延长.因为参与细胞周期G2/M期调控的周期因子Cdc2激酶的活性没有改变,所以提示Sam68不依赖于Cdc2激酶的活性参与细胞周期中G2/M期调控.

沉默Sam68基因对Jurkat细胞增殖影响的研究

本研究探讨Sam68基因对人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat增殖的影响。针对Sam68 mRNA 531-552靶位点设计并合成shRNA,构建pLKO-Tet-On条件性真核干扰载体,制备慢病毒并感染Jurkat细胞;应用强力霉素(Doxycycline)诱导干扰载体表达,用Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,用改良MTT法检测沉默Sam68基因对Jurkat细胞活力的影响,用体外细胞集落形成实验观察沉默Sam68基因对细胞集落形成能力的影响,用流式细胞术分析沉默Sam68前后细胞周期的变化。结果表明:与对照组相比,实验组Sam68基因的表达被有效抑制(P<0.05);沉默Sam68基因降低了Jurkat细胞活力,抑制了细胞的集落形成能力并且导致S期细胞比例显著增加,G2期细胞比例显著降低(P<0.05)。结论:利用shRNA靶向干扰Sam68基因的表达可以有效抑制人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的增殖。

同源重组细胞基因敲除与siRNA基因沉默的效果比较

本研究比较细胞系同源重组基因敲除(gene knockout)与siRNA基因沉默(gene silence)二种技术方法用于研究蛋白功能方面的效果差异。对鸡B淋巴细胞瘤来源的DT40细胞系,应用基因打靶技术分离出Sam68基因缺失的细胞株,并且利用稳定表达siRNA的质粒pSilencer-Sam68得到Sam68基因沉默的细胞株。与野生型细胞株相比,对这些细胞株进行Sam68的功能解析。结果表明:Sam68基因缺失细胞表现出明显的生长速度迟缓,通过细胞周期检测揭示这些细胞生长速度延迟是由于细胞周期中的G2/M期延长;但在Sam68基因沉默细胞中却没有看到这些变化。结论:针对活细胞中的蛋白功能研究,应用细胞系基因敲除技术比siRNA基因沉默技术能够得到更加清晰的实验结果。

Sam68基因过表达可促进乳腺癌MCF-7细胞发生上皮-间质转化

目的 :探讨Sam68(Src-associated in mitosis 68 k D)对乳腺癌MCF-7细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、增殖、迁移和侵袭的影响。方法 :将重组质粒pc DNA-3-Sam68转染至乳腺癌MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测Sam68以及EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)m RNA及蛋白的表达,CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭情况。结果:重组质粒pc DNA-3-Sam68转染MCF-7细胞48 h后,Sam68m RNA和蛋白明显过表达(P值均<0.05)。EMT标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin m RNA的表达水平无明显变化(P值均>0.05),E-cadherin蛋白的表达水平明显下调(P<0.05),而N-cadherin和vimentin蛋白的表达水平则明显上调(P值均<0.05)。并且,细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强(P值均<0.05)。结论 :过表达Sam68基因可增强乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力,这一作用可能与调控EMT的发生有关。