防风提取物对IgE致敏肥大细胞的改善作用及机制研究

[目的]探究防风(Saposhnikovia divaricata,SD)提取物对大鼠嗜碱性白血病细胞RBL-2H3脱颗粒的影响及作用机制。[方法]采用噻唑蓝(methylthialazole tetrazolium,MTT)比色法检测,根据5、25、50、100、200、400μg·mL^(-1)SD提取物对RBL-2H3细胞活性的影响,确定后续实验浓度。以免疫球蛋白E(immunoglobulinE,IgE)诱导建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型。设立空白对照组、模型组、低剂量SD提取物组(5μg·mL^(-1))、中剂量SD提取物组(25μg·mL^(-1))、高剂量SD提取物组(50μg·mL^(-1))和地塞米松(dexamethasone,DXMS)组(100μg·mL^(-1)),干预30 min。MTT法检测低、中、高剂量SD提取物对RBL-2H3细胞脱颗粒模型活性的影响。甲苯胺蓝染色观察脱颗粒细胞形态,计算细胞脱颗粒率。免疫荧光染色测定细胞F-肌动蛋白(F-actin)表达。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞β-氨基己糖苷酶、组胺、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平。免疫印迹法检测细胞磷脂酰肌醇-3-羟基激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)、磷酸化-PI3K(phosphorylation-PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化-AKT(phosphorylation-AKT,p-AKT)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activited protein kinaseelisa,p38MAPK)、磷酸化-p38MAPK(phosphorylation-p38MAPK,p-p38MAPK)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、磷酸化-NF-κB(phosphorylation-NF-κB,p-NF-κB)、细胞外调节激酶(extracellular regulated kinases,ERK)、磷酸化-ERK(phosphorylation-ERK,p-ERK)蛋白表达。[结果]低、中、高剂量防风提取物(5、25、50μg·mL^(-1))对RBL-2H3细胞活性无显著影响(P>0.05)。与空白对照组比较,模型组甲苯胺蓝染色细胞数量减少、形态变圆,细胞脱颗粒率显著上升,F-actin表达下降,β-氨基己糖苷酶、组胺、IL-4、IL-6、TNF-α水平升高,IFN-γ水平降低,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB、p-ERK/ERK表达升高(P<0.01)。与模型组比较,低、中、高剂量SD提取物组和DXMS组细胞F-actin表达增加,β-氨基己糖苷酶、组胺、IL-4、IL-6、TNF-α释放显著下降(P<0.05,P<0.01),IFN-γ释放显著增加(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB、p-ERK/ERK表达降低(P<0.05,P<0.01);中、高剂量SD提取物组和DXMS组细胞数量增加,形态多呈梭形,细胞脱颗粒率显著下降(P<0.01)。与低剂量SD提取物组比较,高剂量SD提取物组和DXMS组细胞脱颗粒率下降(P<0.01)、F-actin表达增加(P<0.05)、p-p38MAPK/p38MAPK表达降低(P<0.01)。[结论]SD提取物可抑制IgE致敏的RBL-2H3细胞脱颗粒,降低炎性介质水平,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT、p38MAPK/NF-κB、ERK蛋白磷酸化有关。

防风石油醚提取物调节中性粒细胞胞外诱捕网对类风湿性关节炎大鼠的改善作用及机制

目的 探究防风石油醚提取物通过调节中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)对类风湿性关节炎(RA)大鼠的改善作用及机制。方法 采用牛Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂建立大鼠RA模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组和防风石油醚提取物低、中、高剂量组(55、110、220 mg/kg),另设不造模的正常组,每组10只。各组大鼠灌胃相应药液或等体积2%吐温-80溶液,每天1次,连续28 d。观察大鼠足趾肿胀度并进行关节炎指数(AI)评分,检测大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、25-羟基维生素D_3[25(OH)D_3]、髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和NETs的水平,观察大鼠踝关节病理学形态变化,检测大鼠踝关节中瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)以及滑膜组织中细胞色素P450 24A1(CYP24A1)、细胞色素P45027B1(CYP27B1)、维生素D受体(VDR)、肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)的表达水平。结果 与模型组比较,防风石油醚提取物中、高剂量组大鼠给药后第14天至第28天的足趾肿胀度和AI评分均显著降低(P<0.05或P<0.01);血清中IL-1β、IL-17、TNF-α、MPO、NE和NETs水平均显著降低,IL-10、25(OH)D_3水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);踝关节间隙变宽,结构明显改善;踝关节中CitH3以及滑膜组织中CYP24A1、PAD4表达水平均显著降低,滑膜组织中CYP27B1、VDR表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论 防风石油醚提取物可能通过调控维生素D系统,抑制NETs生成,进而改善RA症状。

防风总色原酮苷元提取工艺优化及其抗炎活性研究

目的:优化防风总色原酮苷元提取工艺,并初步探究其体外抗炎活性。方法:以升麻素及5-O-甲基维斯阿米醇总提取率为指标,通过响应面法优化防风总色原酮苷元提取工艺;采用脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(RAW 264.7)炎症模型,探究最优参数下防风总色原酮苷元对细胞上清中一氧化氮(NO)含量的影响。结果:最佳工艺为加酶量89.87%,酶解时间59.97 min,酶解温度55.95℃;预测提取率为4.58 mg/g,实际平均提取率为4.49 mg/g,与理论值相差0.09 mg/g,与未加酶提取法相比,提高了3倍;最优参数下防风总色原酮苷元显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞NO分泌,与参比提取物比较,抑制效果显著提高,具有良好的体外抗炎活性。结论:该工艺稳定性好,提取率高,提取物抗炎活性好,为防风药材的开发利用提供了新思路。

HPLC测定防风中色原酮的含量

目的:建立高效液相法测定防风中4种色原酮的方法。方法:采用Diamonsil C18(4.6mm×200mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-水梯度洗脱(甲醇:0～15min,20%～45%;15～25min,45%～70%);流速1mL·min-1。柱温30℃;波长254nm。结果:升麻素苷在0.15～3μg、升麻素在0.02～0.4μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.25～5μg、亥茅酚苷在0.01～0.2μg线性关系良好。结论:该方法快速简便,准确可靠,可用于防风中4种色原酮的测定。

防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的微波提取工艺研究

[目的]优选防风色原酮的微波辅助提取工艺。[方法]以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量为指标,考察了料液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度对防风色原酮含量的影响。[结果]防风微波提取的最佳工艺条件为料液比1∶30(g/ml),乙醇浓度70%,提取温度90℃,提取时间3 min。[结论]微波提取技术具有时间短、效率高的优点,可较好地用于防风色原酮的提取。

防风不同极性部位对腹泻大鼠的止泻作用和结肠不同亚型AQP的调控

为了观察防风不同极性部位对腹泻大鼠止泻作用和对结肠不同亚型水通道蛋白(aquaporin,AQP)影响的比较,将80只SD大鼠随机分为正常组、模型组、地芬诺酯组、防风石油醚萃取部位组、乙酸乙酯萃取部位组、正丁醇萃取部位组、水溶性部位组和总提取物组,每组10只、除正常组外其余各组每天灌胃番泻叶水煎液,连续7天,于第8天开始各组大鼠上午灌胃番泻叶,下午灌胃相应药物,正常组与模型组给予等体积的2%吐温-80溶液,连续给药7天。观察大鼠排便情况,检测大鼠血清中电解质含量和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Na^(+)-K^(+)-ATPase水平,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察结肠病理形态学变化,Western blot分析结肠中不同亚型AQP的表达情况。结果显示防风石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位和总提取物组可降低大鼠的腹泻指数,增加血清中Na^(+)和K^(+)浓度及结肠组织中Na^(+)-K^(+)-ATPase的活性,降低血清DAO和TNF-α的水平,改善结肠黏膜损伤,上调结肠组织中AQP-3、AQP-4和AQP-8的蛋白表达;防风石油醚部位还可下调结肠组织中AQP-9的蛋白表达水平。综上表明,防风具有较好的止泻作用,石油醚部位和正丁醇部位是其止泻的活性部位,且二者对肠道不同亚型的AQP调控具有差异。

提取防风多糖的工艺优化

采用超声波强化和微波辅助提取2种方法提取防风多糖,并与传统热水浸提法在多糖的提取率上进行比较。防风多糖超声提取的最佳工艺条件为超声功率1 000 W、提取时间25 min、液固体积质量比为25,防风多糖微波提取的最佳工艺条件为微波功率560 W、液固体积质量比为30、提取时间10 min,在最佳提取工艺下,2种方法的提取率分别为6.103%和7.639%。与传统热水浸提法相比,超声法和微波法提取防风多糖具有迅速、节能、高效、提取率高等诸多优点。

关防风中残留有机氯农药提取测定方法优化研究

为研究东北产地道药材关防风的有机氯农药残留现状,通过筛选提取溶剂、对比提取方法、选用L_9(3~4)正交设计表优化提取条件,选择最佳净化方法,调整升温程序和载气流速确定最佳气相色谱条件,对关防风中6种有机氯农药的残留量进行分析研究.结果表明用丙酮和二氯甲烷的混合溶剂作为提取剂,通过超声波进行提取和浓硫酸磺化法进行净化,制备供试品溶液.该分析方法适用于能耐受强酸的有机氯农药,符合农药残留分析的要求,该方法简便快速,可以为其他中草药中有机氯农药残留量检测提供参考.

防风总色原酮的超声提取工艺及抗氧化作用研究

为进一步研究防风提取物的抗氧化活性,采用超声提取法,利用L16(45)正交试验设计优选了防风中总色原酮最佳提取工艺条件,研究了总色原酮提取物对二苯代苦味酰基自由基DPPH·和超氧阴离子自由基(O2-)的清除能力及防风总色原酮的抗氧化能力。结果表明:防风总色原酮最佳工艺条件为料液比40∶1,90%乙醇溶液,50℃下超声提取30min,提取频率90Hz,平均提取率达4.05%。防风总色原酮提取物清除DPPH·的IC50值为117.32mg·mL-1,表明防风总色原酮具有较强的抗氧化活性。

防风有效成分的提取工艺研究

目的:优化防风中有效成分的提取工艺。方法:以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷总含量为指标,分别考察超声提取法和乙醇提取法对防风有效成分提取率的影响,并优选提取工艺参数。结果:提取工艺以回流提取法最好,最佳提取工艺为:料液比为1:40(甲醇),提取时间为1.5h,提取1次,防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总提取率达到0.46%。结论:该工艺合理可行,可用于防风有效成分的提取。

羊草草地凋落物对药用植物柴胡和防风的化感作用

采用培养皿滤纸法,以蒸馏水(A:0 mg/mL)作对照,研究了天然草地中3种不同浓度(B:16.2 mg/mL;C:32.3 mg/mL;D:64.6 mg/mL)的羊草凋落物对药用植物柴胡和防风萌发期的化感作用。结果表明,羊草草地凋落物水浸提液对种子萌发没有显著的影响;不同浓度的羊草草地凋落物水浸提液对柴胡和防风胚芽生长的促进或抑制作用不显著,但对其胚根生长有显著(p<0.05)的抑制或促进作用,对其鲜重和干重的作用与对照相比,只有D浓度表现为抑制。

采用改进稠密连接网络的防风药材的道地性识别

目前市场上对防风药材的质量鉴定,仍停留在依靠专业人员的自身经验,对药材表型观察进行划分定级,这样的做法具有一定的主观性和局限性。针对上述问题,该研究建立具有18543张包含5个主要产区防风药材图像的标准数据集,并基于深度学习的方法改进稠密连接网络来区分防风药材的产地,对防风药材品质进行精确、高效的智能分类,判断防风药材的道地性及品质优劣。该神经网络的具体建立过程为:首先对残差模块进行优化改进,将协调注意力(Coordinate Attention,CA)模型与残差模块进行融合,以增加特征图中待识别区域的特征权值,降低背景信息对识别任务的干扰;然后将改进的残差模块嵌入到稠密连接网络,以减少模型运算参数、增强网络对特征信息的高效利用能力;最后重构全连接层,来适应对数据集的识别分类,并增强网络的学习能力。在迁移学习和数据扩充方式下新模型的识别准确率可达97.23%;且训练约48轮便可达到收敛状态,极大地提高了收敛速度。该方法能够高效准确地识别防风药材的产地及道地性并有较强的鲁棒性,可为防风药材质量智能鉴定提供参考。

关防风多糖提取工艺参数的优化

对超声辅助下水提醇沉法提取多糖工艺中液料比、超声温度和超声时间进行优化,找到适用于关防风的最优提取参数。通过对三个因素进行单因素结合响应面试验分析,得到因素影响多糖提取率的大小关系为:液料比>超声温度>超声时间。根据拟合出的数学模型进行计算,得出关防风多糖的最佳提取参数,其中液料比41∶1,超声温度为60℃,超声时间为59 min。本试验优化后的提取参数可作为后续研究防风多糖提取的理论依据,为深入研究防风多糖的应用提供前期基础。

大庆产防风水浸液和煮沸液的荧光光谱

利用RF-5301荧光分光光度计研究了大庆产防风水浸液和煮沸液的荧光光谱特征.实验结果表明,防风水浸液的荧光峰值为430 nm,煮沸液的荧光峰值为427 nm.水浸液在质量浓度为2.83 g/L时荧光峰强度最大,煮沸液在质量浓度为0.92 g/L时荧光峰强度最大.不同浓度的防风水浸液和煮沸液的荧光峰的中心位置基本一致,但荧光强度随浓度的变化而变化.此研究对中药防风的炮制方法和药理学研究提供了一定的参考价值.

防风提取物对肝脏的保护作用

为研究防风提取物(防风水提物和防风醇提物)对肝脏的保护作用,将试验小鼠平均分为9组:空白组,CCl4模型组,阳性药组,防风水提物高、中、低剂量组,防风醇提物高、中、低剂量组。采用四氯化碳(CCl4)诱导小鼠急性肝损伤模型,观察了防风水提物和醇提物对小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的影响,并进行了各组间及组内的比较。结果表明:防风水提物和醇提物高剂量组能显著降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝匀浆MDA含量,提高SOD活性。这说明防风提取物具有一定的保肝作用,其作用机制可能与抗脂质过氧化有关。

防风不同提取部位的燥性差异及其对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜水通道蛋白的影响

目的观察防风Saposhnikoviadivaricata不同提取部位的燥性,考察其对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠滑膜水通道蛋白(aquaporin,AQP)的影响。方法以正常大鼠为对象,选择饮水量、尿量、粪便含水量、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)含量、血液流变学及不同组织中AQP的表达水平为指标,观察防风不同提取部位的燥性效应;采用CIA大鼠模型,通过测定关节肿胀度、炎症因子含量及关节滑膜AQP-1的表达水平,评价防风不同提取部位对CIA大鼠的影响。结果防风石油醚部位明显增加正常大鼠的饮水量、尿量,降低粪便含水量,升高血清中cAMP含量和全血黏度,降低肾组织中AQP-2、颌下腺组织中AQP-5和结肠中AQP-9的表达水平(P<0.05、0.01);防风石油醚部位、正丁醇部位和总提取物能明显降低关节炎大鼠的足肿胀程度,减少血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量,降低滑膜组织中AQP-1的表达水平(P<0.05、0.01)。结论防风石油醚部位具有一定的燥性和抗关节炎作用,防风总提取物具有较好的抗关节炎作用,但未见明显的燥性效应,其机制可能与防风不同部位对不同亚型的AQP差异调控有关。

防风色原酮类对照提取物制备工艺研究

目的:建立防风色原酮类对照提取物制备工艺。方法:采用正交设计实验以及单因素考察法对防风色原酮类成分的提取、富集以及纯化等工艺进行研究,建立防风色原酮类对照提取物的最佳制备工艺,并进行工艺验证。结果:防风色原酮类成分的最佳提取工艺为:10倍量70%乙醇提取3次,每次2 h,合并3次提取液,回收溶剂;防风70%乙醇提取物加水分散,使上样液浓度为3.84 mg/mL(以总色原酮量计),通过AB-8型大孔吸附树脂法柱,吸附流速1.0 mL/min,树脂柱径高比为1∶8,上样量为7.68 mg/mL(以总色原酮量计),以10%乙醇洗脱2 BV进行除杂,流速为1.0 mL/min,再用5 BV 70%乙醇洗脱,流速为2.0 mL/min,收集70%乙醇洗脱液,即为防风色原酮部位;防风色原酮部位加甲醇溶解,与200~300目硅胶按1∶1.3的比例拌样,将硅胶按径高比为1∶15干法装柱,再以环己烷-醋酸乙酯-甲醇(1∶9∶1.5)1.6 BV洗脱,合并含有目标成分的硅胶部分,加甲醇洗脱,回收溶剂、减压干燥得防风色原酮类对照提取物。结论:该研究建立的制备工艺准确性高、重复性好,可用于防风色原酮类对照提取物的制备,为后续防风色原酮类对照提取物的标定定值及相关应用研究等提供了基础。

防风色原酮类对照提取物在玉屏风颗粒含量测定中的应用

目的 通过以防风色原酮类对照提取物及升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷4种单体对照品为对照的对比研究,建立以防风色原酮类对照提取物为对照的对于含防风药味的复方制剂玉屏风颗粒的质量控制方法,考察对照提取物在制剂质量研究中应用的可行性。方法 采用CAPCELL PAK C色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5μm),以甲醇(A)-体积分数0.3%磷酸水溶液(B)为流动相梯度洗脱,对玉屏风颗粒进行含量测定。结果 4种指标性成分在各自的检测质量浓度范围内具有良好的线性关系(r≥0.999 5),精密度、重复性、准确度相对标准偏差(RSD)值均小于3%且稳定性良好。结论 综上,防风色原酮类对照提取物可以替代单体对照品用于玉屏风颗粒含量测定,且操作简便、稳定可靠,为中药质量控制模式的转变提供新的思路与方法。

防风提取物联合三氧化二砷对K562细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨防风提取物联合三氧化二砷（arsenic trioxide, ATO）对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法制备防风提取物，以不同浓度的防风提取物或ATO处理培养的K562细胞48 h，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，应用流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡和细胞周期。结果MTT检测显示，与对照组比较，防风提取物750、1000、1250、1500μg/ml组细胞增殖抑制率[分别为（23.29±3.31）%、（48.30±2.50）%、（79.62±3.41）%、（88.94±0.06）%]升高（P均＜0.05）；防风提取物联合ATO 1.0、0.5μg/ml组增殖抑制率较ATO 1.0、ATO0.5μg/ml组[（64.99±5.18）%比（44.48±3.31）%、（38.59±3.88）%比（26.30±5.03）%]显著升高（P 均＜0.05）。流式细胞检测结果显示，防风提取物联合ATO 2.0、1.0、0.5μg/ml组K562细胞凋亡率较ATO 2.0、1.0、0.5μg/ml组[（33.97±0.59）%比（20.97±2.17）%、（13.53±0.47）%比（9.77±0.64）%、（6.63±0.40）%比（4.00±0.46）%]升高（P均＜0.05）；细胞周期结果显示，防风提取物联合ATO 2.0、1.0、0.5μg/ml组细胞S期细胞比例[（60.25±2.59）%比（55.61±1.28）%、（60.89±1.53）%比（37.96±1.02）%、（47.76±0.87）%比（39.90±0.92）%]明显增加（P均＜0.05）。结论防风提取物对K562细胞具有增殖抑制作用；防风提取物可明显增强ATO对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。ATO可使K562细胞阻滞于G2/M期，而防风提取物与ATO联合应用则使K562细胞阻滞于S期。