外源激素对花鲈(Lateolabrax japonicus)血清IGF-1含量及肝脏IGF-1和IGFBP-1 mRNA表达的影响

对花鲈(Lateolabrax japonicas)成鱼腹腔注射促黄体激素释放激素类似物(LHRH-A3)和人体绒毛膜促性腺激素(HCG),利用放射性免疫激素测定方法(RIA)检测了花鲈血清中类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)在注射后6、12、24、48 h内的变化情况,同时还利用荧光实时定量PCR技术检测了花鲈肝脏中IGF-1和类胰岛素生长因子结合蛋白1(Insulin-like growth factor-binding protein 1,IGFBP-1)mRNA的相对表达量的变化情况。结果表明,注射LHRH-A3的花鲈血清中IGF-1的含量在24 h后出现了明显的降低(P<0.05),而花鲈肝脏中IGF-1 mRNA的相对表达量在注射6 h后较对照组明显升高(P<0.05),而肝脏中IGFBP-1 mRNA的相对表达量则呈现下降趋势。注射HCG的花鲈血清中IGF-1的含量在注射后12 h出现了明显降低(P<0.05),24 h后血清中IGF-1含量持续降低。肝脏中IGF-1 mRNA的相对表达量在注射后的24 h内均保持稳定,而在处理后的48 h出现了显著上升(P<0.05)。肝脏中IGFBP-1 mRNA的相对表达量在注射后12h检测到显著升高(P<0.05)。研究结果表明,LHRH-A3和HCG均可以通过直接或间接的刺激作用来触发花鲈IGF系统的应答反应,但是其中具体机制尚不明了。

饥饿对于鲈肌肉、肝脏和血清主要生化组成的影响

于 2 2 93± 2 15℃条件下 ,在室外水泥池 (3m× 2m× 1m)中对正常鲈 (2 85 2 6± 6 5 4 g)和患脂肪肝病鲈 (4 6 4 71± 5 4 2 2g)进行为期 9周的饥饿处理。分别在实验开始后第 0周、 3周、 5周、 7周和 9周取样 ,以观察饥饿对于鲈内脏相对重量、肌肉肝脏和血清主要生化指标的影响。研究表明 ,鲈对饥饿耐受能力较强 ,在饥饿时首先快速动用肠系膜脂肪和肌肉脂肪作为能量供应 ,而在整个饥饿阶段则主要以肌肉蛋白质作为能量来源 ,肝脏中能源物质在饥饿中并无明显减少 ,故不是鲈饥饿时的主要供能物质。饥饿时 ,肌肉和肝脏中的水分和脂肪含量呈现负相关 ,尤其在肝脏中表现明显。鲈血清中脂肪酶、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白在饥饿中表现出周期性和阶段性的变化 ,其中正常鲈表现出有规律的波浪状图形 ,而脂肪肝病鲈则表现出山峰状图形 ,说明脂肪肝病鲈代谢机制不如正常鲈灵敏 ,9周的饥饿并不能减轻或消除鲈的脂肪肝病.

花鲈对不同饲料原料的表观消化率

试验以Cr2 O3 为指示物 ,以 70 %基础饲料和 30 %的待测饲料原料组成试验饲料 ,测定花鲈对红鱼粉、豆粕、花生粕、菜籽粕、肉骨粉和棉籽粕中干物质、粗蛋白、粗脂肪、能量和氨基酸的表观消化率。在水温 2 5± 1℃的试验条件下 ,花鲈对鱼粉、豆粕、花生粕的干物质表观消化率均在 6 0 %以上 ;对鱼粉、豆粕、花生粕和菜籽粕的蛋白质、脂肪的表观消化率都在 80 %以上 ;花鲈对能量的表观消化率变化范围在 16 99%— 83 96 %。测得每种原料的 16种氨基酸的表观消化率 :花鲈对原料氨基酸消化率的变化与对蛋白质消化率的变化相一致 ,除了赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸之外 ,花鲈对肉骨粉中氨基酸的利用率最低。花鲈对饼粕类原料中的含硫氨基酸 (如蛋氨酸 )的表观消化率低于其他氨基酸 ,对鱼粉中氨基酸利用率最低的为组氨酸 ,对肉骨粉中氨基酸利用率最低的为苏氨酸。

鲈鱼胚胎的玻璃化冷冻保存

本文对鲈鱼 (Lateolabraxjaponicus)胚胎进行了玻璃化冷冻保存研究 ,筛选出了浓度较低、玻璃化程度较稳定的 5种玻璃化液 ,冷冻时形成玻璃化的概率在 4 8 1%～ 10 0 % ,在 35～ 4 3℃的水浴中解冻时保持玻璃化的概率在 4 4 4 %～ 6 3 0 % ;玻璃化液VSD2在解冻时保持玻璃化的概率最高。对鲈鱼神经胚、 2 0对肌节胚、尾芽胚、心跳胚、出膜前胚在玻璃化液VSD2中的适应能力及适合于玻璃化冷冻的胚胎时期进行了比较 ,结果显示 :不同时期胚胎对玻璃化液的耐受能力不同 ,鲈鱼神经胚耐受能力最低 ,心跳胚耐受能力最强 ,出膜前期胚次之 ,心跳胚和出膜前胚适合于进行玻璃化冷冻。对 0 5mol/L蔗糖的洗脱时间进行了选择 ,结果显示 ,洗脱10～ 2 0min效果较好。利用玻璃化程度较好的VSD2对鲈鱼不同时期胚胎进行超低温 ( - 196℃ )冷冻 ,获得了2 1%～ 2 7 9%的透明胚。将鲈鱼心跳胚冷冻解冻后获 2粒复活胚 ,培养至出膜期 ,成活 4 2～ 5 0h ;出膜前期胚在冷冻解冻后有 1粒胚复活 。

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈 (Lateolabraxjaponicus)弧菌病的病原菌———鳗弧菌 (Vibrioauguil larum)W 1为抗原 ,制备兔抗血清 ;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清 (HRP IgG)为酶标二抗 ,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明 ,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度 ,最低的检测量为 10 5个 /ml,即 10 4 个 /孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对 4 6份人工感染后的花鲈组织样品 ,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明 ,阳性检测率为 76 .1%。

鲈鱼鳗弧菌病疫苗的制备及免疫防治效果

以从患出血、烂尾病的鲈鱼 ( L ateolabrax japonicus)中分离的 1株致病性鳗弧菌 W- 1( Vibrio anguillarum)为材料 ,进行了鳗弧菌全细胞灭活疫苗研制 ,比较了福尔马林、苯酚、氯仿等不同灭活剂在不同温度下的灭活效果。最终确定以 0 .5 % ( v/ v)的福尔马林溶液在 2 8℃下处理 4 8h为最佳灭活条件 ,所用的菌悬液浓度为 2 .5× 10 9cfu/ m L。用福尔马林灭活的 W- 1( Vibrio anguil-larum)疫苗 ,分别浸泡免疫鲈鱼苗和注射成鱼 ,并检测了疫苗对鱼体的免疫保护力。结果表明 ,经疫苗浸泡免疫 4周后的鲈鱼苗免疫保护力达 64.7% ,90 d后同批次的鲈鱼再注射免疫 ,其免疫保护力为 78.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 192。仅进行注射免疫组 ,其免疫保护力为 5 7.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 2 2 4。

中性植酸酶在豆粕型饲料中替代磷酸二氢钙对花鲈生长及磷代谢的影响

本文旨在研究豆粕型饲料中用中性植酸酶替代不同水平的磷酸二氢钙,对花鲈(Lateolabrax japonicus)生长和磷代谢及利用的影响。以(2.52±0.01)g的花鲈为试验对象,用中性植酸酶分别替代试验用的豆粕型饲料中60%(PE6)、80%(PE8)和100%(PET)的磷酸二氢钙,每个替代水平饲料中分别设置1000FTU/kg(PE610,PE810,PET10)和1500FTU/kg(PE615,PE815,PET15)2个梯度。8周的养殖试验结果显示,在豆粕型饲料中用中性植酸酶替代磷酸二氢钙后,对各试验组花鲈的生长、鱼体成分和蛋白质消化率均无显著影响(P>0.05);但PE615和PE815组的干物质消化率显著高于对照组(P<0.05),PE815组的脂肪消化率显著高于PE610、PET10和PET15组(P<0.05),而PE615和PE815的总磷消化率显著高于对照组、PE610组和PET15组的(P<0.05)。各试验组的总磷摄入量、表观磷的摄入量、粪磷和非粪磷的排出量均随试验料中磷酸二氢钙添加量的减少而显著降低(P<0.05),而除PE610和PE815以外的各试验组的总磷储积率却显著高于对照组(P<0.05)。根据本试验的结果,在含有30.5%豆粕的花鲈饲料中添加一定量的中性植酸酶同时减少磷酸二氢钙的添加量后,仍能显著提高饲料中磷的消化和利用(P<0.05)。中性植酸酶的添加量以1000FTU/kg饲料为宜,其作用相当于12g/kg的磷酸二氢钙。

低盐度可诱导鲈鱼胞浆型PEPCK基因表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸,是糖异生途径的第1个限速酶.本研究用SMARTRACE技术从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的全长cDNA序列.该基因全长2215bp,包含1个123bp的5′非翻译区和217bp的3′非翻译区,开放阅读框为1875bp,编码1个由624个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论分子量为69.1kD,等电点为5.87.氨基酸序列分析表明,与其它动物的胞浆型PEPCK相似性很高,与黑鲷为94.2%,与大西洋鲑为86.4%,与人为75.9%,而与该鱼线粒体型PEPCK氨基酸同源性只有70.6%.系统发育分析显示,该蛋白首先与其它动物的cPEPCK聚成一支,然后再与鱼类的mPEPCK成簇,认为该PEPCK属于胞浆型.同时用RT-PCR分析了PEPCK基因在10个组织中的表达,结果表明只有在肝脏、消化道和肾脏有较高的表达.将鲈鱼从盐度为25的海水转入盐度为12的海水48h后,肝脏和肾脏的PEPCK基因表达有增加.实验结果表明,本实验克隆的为鲈鱼胞浆型PEPCK,低盐度可诱导其表达.

壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响

在基础饲料中分别添加0.5%、1%和2%的壳聚糖,连续投喂花鲈(Lateolabrax japonicus)60d,探讨壳聚糖对花鲈生长和非特异性免疫力的影响。结果表明,添加0.5%和1%壳聚糖可以显著促进花鲈的生长,但是不同添加浓度对成活率均无影响。在30d时添加0.5%或1%壳聚糖能有效提高花鲈的补体活性、溶菌酶活性和吞噬活性;在60d时仅明显提高补体活性。添加壳聚糖对白细胞的数量没有影响。

鲈鱼口服生物胶囊疫苗的研究

以暴发弧菌病的鲈鱼 (Lateolabraxjaponicus)鱼苗体内分离的 1株病原菌W 1(Vibrioanguillarum)为材料 ,分别以直接浸浴法、创伤后浸浴法和肌肉注射法人工感染鲈鱼鱼苗。结果表明 ,这三种感染方式均能使鲈鱼发病 ,其半致死浓度 (LD50 )分别为2 75× 10 7cfu/ml ,4 .68× 10 6cfu/ml和 3.72× 10 5cfu/尾。在此基础上 ,分别以福尔马林灭活法和喷雾干燥法制备了全细胞疫苗和微胶囊疫苗。将全细胞疫苗及微胶囊疫苗以直接拌入饵料法和卤虫携带法等两种方法口服免疫接种鲈鱼鱼苗 ,一周后以W 1活菌攻毒( 2 50× 10 6cfu/尾 )。结果表明 ,各免疫组一周的累积死亡率远低于两组对照组 ( 95% )。其中 ,以卤虫携带的生物微胶囊疫苗组的一周累积死亡率最低 ,为 2 5.0 % ;以卤虫携带的生物全细胞疫苗组的一周累积死亡率较高 ,为 60 .0 %。因而 ,以卤虫携带的生物胶囊疫苗组的免疫保护力最高 ,为 73.7% ,其次为微胶囊疫苗直接投喂组 ,保护力为 56.8%。直接投喂和卤虫携带法的全细胞疫苗也显示了一定的免疫效果 ,其免疫保护力分别为 52 .6%和 36.8%。

海水和淡水养殖花鲈肌肉脂肪酸组成和含量分析

采用Folch液回流提取投喂相同配合饲料的海水养殖花鲈和淡水养殖花鲈背部肌肉脂质,脂质经氢氧化钾-三氟化硼法甲酯化后进行气相色谱分析。结果表明:海水养殖花鲈和淡水养殖花鲈肌肉脂肪酸组成存在一定差异。海水花鲈肌肉脂肪酸中单不饱和脂肪酸(MUFA)、n-3系列多不饱和脂肪酸(PUFA)、EPA(C20:5n-3)和DHA(C22:6n-3)含量明显高于淡水花鲈,而饱和脂肪酸(SFA)、n-6系列PUFA和AA(C20:4n-6)含量则低于淡水养殖花鲈。海水养殖花鲈和淡水养殖花鲈肌肉中n-6和n-3系列PUFA比值分别为0.27和0.42,均远低于HMSO(英国卫生部)推荐的最高安全限值(4.0)。

晶体氨基酸提高混合动物蛋白替代花鲈饲料中鱼粉的潜力

实验以鸡肉粉∶牛肉骨粉∶喷雾血球干燥粉∶水解羽毛粉=40∶35∶20∶5的比例组成的混合动物蛋白(animal protein blend,APB)分别直接替代或在补充赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸后替代花鲈饲料中50%、75%、100%的低温干燥鱼粉,研究其对花鲈生长及生理功能的影响。经过8周的饲养后发现,花鲈的生长性能随替代比例的提高而降低;摄食含APB饲料的花鲈,其成活率,摄食率和生长性能均显著低于对照组(P<0.05)。与APB直接替代鱼粉的处理组相比,添加3种必需晶体氨基酸极显著提高了花鲈的生长性能及全鱼蛋白、脂肪、能量含量(P<0.01),显著降低了花鲈的全鱼水分、灰分,肝指数及脏体比(P<0.05)。晶体氨基酸与APB的替代水平对花鲈的生长性能、形体指标及体组成成分存在显著的交互作用(P<0.05)。实验结果表明,(1)混合动物蛋白替代初始体重为13.2 g的花鲈饲料中白鱼粉的比例应小于50%;(2)添加必需晶体氨基酸能显著提高APB在花鲈饲料中的应用潜力;(3)花鲈具备一定的利用晶体氨基酸的能力。

应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌——鳗弧菌

以花鲈 (Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌——鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) W-1为抗原 ,制备兔抗血清 ;利用异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白 (FITC-Ig G)为荧光标记二抗 ,并以罗丹明标记的牛血清白蛋白为背景染色 ,建立检测鳗弧菌的间接荧光抗体快速检测技术。应用该技术对人工感染后的花鲈组织 (肌肉、鳃、肠、肾 )样品和养殖水体样品进行了鳗弧菌检测 ,结果显示间接荧光抗体技术不仅可以用于诊断发病的感染花鲈 ,也可用于检测带菌状态或未发病的感染花鲈。

海水养殖花鲈对几种饲料蛋白原料的表观消化率

测定了在室内海水流水系统中养殖的花鲈对7种常用饲料原料,宠物级鸡肉粉(P-PBM)、饲料级鸡肉粉(F-PBM)、血粉(BM)、羽毛粉(FEM)、蚕蛹粉(SWP)、豆粕(SBM)和菜粕(RSM)以及1种混合动物蛋白粉(MM=50%P-PBM+20%F-PBM+20%BM+10%FEM)的干物质、蛋白质和能量表观消化率(ADC)。实验饲料由70%基础饲料(蛋白质含量为42.0%,能量含量为18.9MJ/kg)和30%的待测原料组成。基础饲料和实验饲料中均添加1%(质量分数)的Cr2O3作为外源标记物。饲养实验共进行4周。实验期间每天投饵两次,采用虹吸方法收集粪便。实验结果显示:花鲈对P-PBM、F-PBM、BM、FEM、MM、SWP、SBM和RSM干物质ADC分别为61%～87%,蛋白质ADC为80%～96%,能量ADC为75%～93%。其中,花鲈对SBM的蛋白质ADC最高,对MM的蛋白质ADC最低,对BM的干物质和能量ADC最高,对RSM的干物质和能量ADC最低。

鲈鱼土池人工育苗研究

报道了 1 989～ 1 993年鲈鱼土池人工育苗的研究结果。捕自天然海区、围垦内湾和网箱培育的亲鱼注射 LRH- A与 HCG诱导能顺利排卵 ,产卵率 70 %～ 1 0 0 % ,受精卵卵径 1 .2 5～ 1 .40 mm,浮性卵 ,受精率 2 1 .0 %～ 89.0 % ,在水温 1 8.0～ 2 1 .2℃、盐度 31 .0～ 34.0的条件下 ,一般经 5 0 .6 7h孵出仔鱼 ,孵化率46 .0 %～ 90 .0 %。人工育苗在室外土池进行 ,最高成活率 1 1 .7%。初孵仔鱼全长 3.5 3～ 4.2 8mm,经培育 6 0 d左右变态为幼鱼。 1 989年 ,1 990年 ,1 991年 ,1 992年和 1 993年分别育出幼鱼 2 790 ,2 4770 ,30 741 ,1 1 6 41及 1 0 5 0 0 0尾 ,全长为 2 .33～ 5 .1 6 cm。

花鲈胚胎干细胞移植及嵌合体的构建

旨在通过花鲈胚胎干细胞（LJESl）移植构建嵌合体，证实LJES1细胞的体内分化能力和发育全能性。采用脂质体介导法将线性化pCMV-EGFP质粒导入到长期培养的LJES1细胞内，细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达率为5％～10％，以此为供体，通过显微注射方法把20—50个LJES1细胞移植到花鲈囊胚中，共移植囊胚478枚，获得了20枚表达GFP的嵌合体胚胎，其中的15枚胚胎发育成鱼苗。荧光显微观察和PCR检测显示了LJES1细胞可在宿主胚胎内片状嵌合和单细胞分散嵌合，嵌合部位可分布于胚体的三个胚层；同时也证明GFP是一种优良的遗传标记。本实验结果为证实LJES1细胞的发育全能性提供了有力证据。

复合微生态制剂对花鲈非特异性免疫力及抗病力的影响

将复合微生态制剂以0（control）、500mg/kg（PR-500）和3000mg/kg（PR-3000）的添加量加入到花鲈（Lateolabraxjaponicus）基础饲料中,在饲喂42d和84d后分别取样,以血清溶菌酶活力、替代补体活力（ACH50）、头肾巨噬细胞杀菌力及呼吸爆发活力为判据,确定微生态制剂对花鲈非特异性免疫力的影响;用鳗弧菌Vibrio anguillarum对饲喂84d后的花鲈进行攻毒实验,测定累积死亡率,以确定微生态制剂对花鲈抗病力的影响。结果表明,饲喂84d时,实验组的特定生长率（SGR）较对照组有增高的趋势,但与对照组间无显著性差异（P〉0.05）。饲喂42d时,实验组花鲈的血清溶菌酶活力与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）;84d时,实验组的溶菌酶活力显著低于对照组（P〈0.05）。饲喂42d与84d时实验组花鲈的替代补体活力（ACH50）与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）;饲喂84d时,实验组花鲈巨噬细胞的呼吸爆发活力与对照组相比无显著性差异（P〉0.05）;PR-3000组花鲈的巨噬细胞杀菌力显著高于对照组（P〈0.05）;实验组花鲈的头肾巨噬细胞数量显著高于对照组（P〈0.05）。攻毒实验结果显示,对照组花鲈最早出现死亡;攻毒后第27~32h期间,对照组花鲈的累积死亡率显著高于实验组（P〈0.05）。

鲈鱼生长催乳素的分离纯化与N-末端序列分析

生长催乳素（ＳＬ）是生长激素／催乳素家族的一种新的脑垂体蛋白质激素，本研究首次从鲈鱼脑垂体中分离得到．鲈鱼脑垂体在碱性条件下，经葡聚糖凝胶（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００）过滤和反相高效液相色谱（ｒｐＨＰＬＣ）分离出纯化的鲈鱼生长催乳素，（ｓｂＳＬ），并与大麻哈鱼生长催乳素（ｓＳＬ）抗体发生特异性的Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹交叉反应证实。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析，发现鲈鱼生长催乳素分别是由分子量为２３．２×１０３和２８．４×１０３ｕ两种形式组成（后者可能是一种糖基化形式）．根据Ｅｄｍａｎ降解原理，测得鲈鱼生长催乳素的Ｎ－末端１６个氨基酸的序列，它与已知鱼类生长催乳素的Ｎ－末端序列比较，具有较高的同源性；由此进一步证实，分离纯化得到的鲈鱼生长催乳素是正确的。