秋水仙素诱导天山雪莲四倍体的研究

利用组织培养附加秋水仙素的方法对濒危药用植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)进行多倍体诱导,结果表明:(1)与种子作材料相比,采用秋水仙素处理无菌苗是获得天山雪莲多倍体植株的最佳途径.(2)二倍体植株的叶片薄、平展、较细长、色绿、尖齿不明显、根细长;经秋水仙素处理诱导得到的植株叶片变宽、变肥厚、叶色深绿,尖齿明显、根短粗.(3)染色体计数、气孔分析及流式细胞仪倍性综合检测表明,诱导得到的多倍体变异苗为纯合四倍体.

天山雪莲LEA14基因克隆及功能分析

从天山雪莲叶片低温诱导的EST文库中获得了1个胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA)cDNA全长序列。序列分析表明,该基因含有1个468bp编码155个氨基酸的开放阅读框。NCBI保守域预测此蛋白属于LEA_2家族,命名为SiLEA14。系统进化分析表明,该蛋白与北柴胡的LEA-2蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,SiLEA14表达量在低温、盐和干旱胁迫条件下迅速升高。亚细胞定位结果表明,SiLEA14蛋白定位于细胞核中。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,测定并分析转基因植株在冷冻和盐胁迫处理下的生理指标,结果表明,SiLEA14基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗冻和耐盐能力。

雪莲的研究进展

雪莲是我国珍稀名贵的中药材 ,具有很高的药用价值 ,应用前景广阔。雪莲生长环境恶劣 ,自然资源十分有限。由于近年来野生雪莲乱采滥挖现象严重 ,加之人工栽培困难 ,雪莲已被列为国家三级濒危物种而受到保护。综述雪莲的有效成分、药理作用、开发利用现状及解决雪莲资源短缺的途径 ,并对雪莲今后研究发展的方向进行了展望 ,以期更加有效地保护和合理开发利用雪莲资源、满足医药市场需求、保护西部生态环境和促进西部经济发展。

天山雪莲乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体的保护作用研究

目的:研究天山雪莲乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体的保护作用。方法:将BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、缺氧模型组、乙酰唑胺阳性对照组、天山雪莲提取物组,给药后将小鼠放入低压氧舱,减压至模拟海拔8 000 m高度,小鼠保持在此高度下缺氧12 h后处死小鼠,提取肝脏线粒体。测定线粒体膜电位、线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和苹果酸脱氢酶、顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶的活性。结果:与缺氧模型组比较,天山雪莲提取物能够保护线粒体膜电位,提高顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ的活性。结论:天山雪莲乙醇提取物能够保护缺氧小鼠肝脏线粒体功能。

天山雪莲PsbO基因的克隆、原核表达及其烟草中的遗传转化

从已建立的天山雪莲抗寒cDNA文库中筛选克隆了雪莲的PsbO基因,发现该基因全长1145bp,编码329个氨基酸。通过构建原核表达载体在大肠杆菌中成功获得表达,同时构建了植物表达载体,转化烟草,并获得了部分转基因植株。

转天山雪莲冷调节蛋白基因烟草的获得及其抗寒性鉴定

从已建立的天山雪莲cDNA文库中随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增出基因序列并测序,然后将该序列在GenBank中进行比对,根据该序列设计特异引物进行PCR,最终获得了冷调节蛋白基因siCOR的完整开放读码框(ORF);构建植物表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,用RT-PCR对转化烟草进行鉴定,收取种子后筛选出纯合的T3株系,并通过冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果表明:(1)siCOR大小661bp,与禾本科植物粳稻的冷调节蛋白基因一致性最高(65.04%)。(2)与野生型植株相比,转siCOR基因烟草均叶片浓绿、无分支侧芽,生长快;在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因的烟草叶片相对含水量、PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株,而且转siCOR基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,受到的伤害也较轻。研究发现,在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因烟草植株表现出良好的生理和生长优势,显示出了较强的抗寒特征。

新疆雪莲全长cDNA文库构建及表达序列标签(ESTs)特性分析

以野生新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kit)为研究材料,利用Creator SMARTTMcDNA Library Construction技术构建了雪莲全长cDNA文库,从野生雪莲中提取总RNA和mRNA,用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链。通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA。将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上,并对噬菌体进行包装,建成cDNA的全长库。经大肠杆菌XL1-Blue平板检测,原始文库滴度达4.03×107(pfu/mL)。随机挑选500个克隆进行序列测定,PCR鉴定结果显示多数插入片段均在500 bp以上。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,共有56个序列为非冗余数据。其中有14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,42个片段与已报道的基因有较高的同源性。这些EST数据为进一步筛选和克隆雪莲特异性表达基因提供了材料平台,为雪莲基因组数据增补了大量信息。

新疆雪莲多倍体的诱导初探

用秋水仙素和2%二甲基亚砜共同处理新疆雪莲种子、胚根和茎段,以诱导多倍体雪莲。结果表明,茎段经过100 mg.L-1秋水仙素处理3 d诱导效果最佳,同时,离体培养其嵌合体苗茎段及叶片,诱导不定芽生成,获得了四倍体细胞比例达到90%以上的植株。

天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究

目的:研究不同培养条件对天山雪莲愈伤组织生长及总黄酮产生的影响,探讨组织培养生产总黄酮的可能性。方法:通过脱分化培养获得天山雪莲愈伤组织,并对该组织含有的总黄酮进行测定。结果:在MS+NAA+6-BA培养基上培养10～15d,能获得紫红色愈伤组织,且总黄酮含量较高;温度梯度、NH4NO3浓度、培养基和培养时间对愈伤组织的生长和总黄酮产生均有显著影响。结果:天山雪莲愈伤组织培养条件对总黄酮产生有影响。

新疆雪莲组织培养体系的优化

以新疆雪莲无菌苗的根、茎、叶为外植体,对各种不同激素配比条件下新疆雪莲的再生体系进行了探讨,结果表明:培养基MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 2.0 mg/L对愈伤组织诱导效果较好;而再生芽的诱导培养基为MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.05mg/L+水解乳蛋白500mg/L;生根培养基为1/4MS+NAA 0.3 mg/L。

天山雪莲HPLC指纹图谱研究

目的建立天山雪莲药材的HPLC指纹图谱，为雪莲药材的快速质量控制提供依据。方法以绿原酸、紫丁香苷、芦丁、木犀草素、芹菜素5种对照品为对照，采用HPLC法，测定了10批次不同产地天山雪莲的色谱图，确立参照指纹图谱。色谱条件：色谱柱Diamonsil^TM C18（250mm×4．6mm，5μm），甲醇-水（0．8％醋酸，0．2％三乙胺，pH3．5-4．0）线性梯度洗脱，柱温30℃，检测波长270nm，记录时间30min，体积流量1．0mL／min。结果标示出天山雪莲的13个特征指纹峰。结论该方法准确、重现性好，为天山雪莲的指纹图谱质量控制提供了参考。

天山雪莲水提取物对小鼠辐射损伤的保护作用

目的 观察天山雪莲水提取物 (ES)对电离辐射损伤小鼠的保护作用。方法 小鼠igES 0 .75 ,1.5 ,3.0g/kg ,14d后接受 8和 2 .5Gy的照射 ,观察 8Gy照射小鼠的平均生存时间和生存率及 2 5Gy照射小鼠的脾T淋巴细胞转化能力和骨髓DNA含量。结果 ES能显著延长 8Gy照射小鼠的平均生存时间 (P <0 0 5 ) ,并提高生存率 ;显著提高 2 5Gy照射小鼠的脾T淋巴细胞转化能力和骨髓DNA含量 (P <0 0 5 ,0 0 1) ,改善免疫功能。结论 ES具有抗辐射损伤作用。

天山雪莲悬浮培养细胞总黄酮提取纯化工艺研究

【目的】分析天山雪莲悬浮培养细胞生长过程中生物量和总黄酮含量的变化,优化总黄酮的提取纯化方法。【方法】采用L9(34)正交设计优化天山雪莲悬浮培养细胞中总黄酮的超声提取工艺,比较聚酰胺层析法、碱提酸沉法和聚酰胺酸碱法对总黄酮含量、纯度及回收率的影响。【结果】在3～15d,随着培养时间的增加,天山雪莲悬浮培养细胞的生物量和总黄酮含量明显增加,在培养15d时均较高,分别为21.9g/L和66.5mg/g,表明天山雪莲悬浮培养细胞最适收获时间为培养15d;总黄酮提取最佳工艺为:70℃超声条件下,采用体积分数70%的乙醇连续提取3次,可以得到66.5mg/g总黄酮;总黄酮纯化的最佳方法为:聚酰胺层析法和碱提酸沉法联用,即聚酰胺酸碱法,获得的总黄酮纯度和回收率均较高,分别为6.86g/kg和47.6%。【结论】获得了天山雪莲悬浮培养细胞总黄酮提取和纯化的最佳方法,为天山雪莲药制品的工业化生产提供了参考。

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。

新疆雪莲化学成分的分离与鉴定

目的对新疆雪莲的化学成分进行研究。方法采用硅胶、凝胶柱色谱和重结晶等分离方法对体积分数为75%的新疆雪莲乙醇溶液提取物进行成分分离,通过谱学分析方法结合理化性质进行结构鉴定。结果共分离得到8个化合物,分别鉴定为大苞雪莲内酯(involucratolactone,1)、11α,13-dihydrozaluzanin-C(2)、dihydrozaluzanin-C(3)、7β-羟基谷甾醇(7β-hydroxysitosterol,4)、7β-羟基豆甾醇(stigmast-5,22-dien-3β,7β-diol,5)、山奈酚(kaempferol,6)、高车前素(hispidulin,7)、粗毛豚草素(jaceosidin,8)。结论化合物3、5为首次从风毛菊属植物中分离得到,化合物2、4为首次从新疆雪莲植物中分离得到。

植物激素和活性炭对新疆雪莲组培苗生根的影响

研究了不同植物激素和活性炭对新疆雪莲组培苗生根的影响,测定了根长、根粗、根数和生根率4个生根指标,结果表明:添加生长素IAA、IBA和NAA均可以不同程度地促进生根,但0.2mg/L的IAA效果最佳,根长最长达5.5mm,根粗最小0.96mm,根数最多达9.75条,生根率达100%;添加活性炭可以提高生根质量,最适添加量为1mg/mL。此时,根长最长达25.51mm,根粗最小为0.6mm,根数最多达13条,生根效果最佳。

HPLC法建立新疆雪莲指纹图谱研究

目的 :对 7种不同产地的新疆雪莲药材进行指纹谱比较研究。方法 :以乌鲁木齐南山产新疆雪莲药材为分析对象 ,选择适宜的色谱条件 ,建立了 7个不同产地的新疆雪莲药材样品的指纹图谱。结果 :方法学考察表明 ,本研究建立的分析方法有比较好的重现性 ;不同产地的新疆雪莲药材共有峰相对保留时间基本一致 ,但其相对面积存在一定的差异。结论 :指纹谱分析方法可简便、快速的鉴别和区分不同产地的新疆雪莲药材。

天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。

新疆雪莲的香豆素类化学成分的研究

目的研究新疆雪莲(SaussureainvolucrateKar·etKir)的化学成分。方法应用各种柱色谱的方法进行分离;应用化学和各种光谱分析的方法鉴定化合物。结果从新疆雪莲的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到8个香豆素类成分,它们分别为蛇床子内酯(osthol),佛手内酯(bergapten),异茴芹内酯(isopimpinellin),爱得尔庭(edultin),叶鞘二醇二乙酸酯(vaginidioldi-acetate),别异因波拉托内酯(alloisoimperatorin),噢洛内酯(oroselol),花椒香豆素(xanthotoxol)。结论这8个香豆素均为首次从新疆雪莲中分离得到。

新疆天山雪莲组培快繁技术的建立

[目的]探讨新疆天山雪莲组培快繁技术。[方法]以新疆雪莲切除根部的无菌苗,或无菌苗的真叶,或者直接采集野生的新疆雪莲幼嫩部位作外植体,进行愈伤组织诱导培养及丛生芽分化、丛生芽增殖继代培养、生根培养和组培苗移栽试验。[结果]新疆天山雪莲外植体在MS+NAA 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L和MS+6-BA 1.0+NAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培养基上可诱导产生大量的丛生芽;在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L培养基上交替培养,丛生芽继代快速增殖率达1.0∶3.5;组培苗在MS+NAA 0.2 mg/L培养基上诱导生根,生根率达83%;生根的雪莲组培苗经炼苗和移栽后成活,生长健壮。[结论]该研究建立的快繁技术为雪莲野生资源保护和产业化发展开拓了一条有效途径。