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人源抗HBsAgscFv与重组复合干扰素融合蛋白的高效表达及活性鉴定 被引量:2
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作者 刘顺爱 浅野龙太郎 +3 位作者 王学 熊谷泉 工藤俊雄 徐道振 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期629-632,638,共5页
目的 :制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)单链抗体 (scFv)与重组复合干扰素 (consensusinterferon ,cIFN)的融合蛋白 ,并鉴定其活性。方法 :把人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白的表达载体pRA cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL2 1之后大... 目的 :制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)单链抗体 (scFv)与重组复合干扰素 (consensusinterferon ,cIFN)的融合蛋白 ,并鉴定其活性。方法 :把人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白的表达载体pRA cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL2 1之后大量表达抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白。SDS PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白 ,经纯化并变性复性包涵体蛋白后用ELISA、流式细胞仪、MTS非放射性活细胞比色定量法及HBsAg血凝抑制试验等进行融合蛋白的抗HBsAg抗体活性和干扰素活性测定。结果 :SDS PAGE和Westernblotting结果显示 ,抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白在BL2 1大肠杆菌中大量表达 ,表达量超过 10mg L培养基 ;ELISA和流式细胞仪结果显示 ,所表达的目的蛋白具有抗HBsAg和IFNα的免疫活性 ,且特异性良好 ;MTS和HBsAg血凝抑制试验结果显示 ,融合蛋白具有明显的PLC PRF 5细胞增殖抑制活性和HBsAg分泌抑制活性 ,表明所获得的抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白具有抗HBV病毒活性和HBV感染细胞增殖抑制活性。结论 :用基因工程方法成功制备了人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白 ,此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和IFNα活性 。 展开更多
关键词 HBSAG 人源单链抗体 cIFN 融合蛋白 原核表达 活性
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不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响 被引量:6
2
作者 赵宝华 许崇波 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期8-13,共6页
将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3)。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3)... 将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3)。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3)在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和α毒素的活性。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌a毒素 单链抗体 基因表达 中和活性
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融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析 被引量:3
3
作者 高国辉 王金丹 +5 位作者 黄奇迪 杨纪峰 杨水兵 包兵兵 张羽 胡孝渠 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1034-1040,共7页
目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达... 目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。 展开更多
关键词 抗HER2单链抗体可变区片段 绿色荧光蛋白 融合基因表达
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融合蛋白IP10-EGFRvⅢScFv的构建及表达 被引量:1
4
作者 王旋 赵洪洋 +3 位作者 罗赤星 周毅 张方成 姜晓兵 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期1-6,共6页
目的构建细胞因子融合蛋白IP10-EGFRvⅢScFv,建立并检测稳定表达融合蛋白的细胞株NIH3T3。方法通过RT-PCR法扩增小鼠IP10基因,全基因人工合成EGFRvⅢScFv,两段目的基因依次克隆于表达载体pcDNA3.1(-)PCMV启动子下游,二者以编码(Gly4Ser)... 目的构建细胞因子融合蛋白IP10-EGFRvⅢScFv,建立并检测稳定表达融合蛋白的细胞株NIH3T3。方法通过RT-PCR法扩增小鼠IP10基因,全基因人工合成EGFRvⅢScFv,两段目的基因依次克隆于表达载体pcDNA3.1(-)PCMV启动子下游,二者以编码(Gly4Ser)3的柔性接头序列(linker)相连。将构建好的pcDNA3.1(-)IP10-EGFRvⅢScFv转染NIH3T3细胞,并用G418筛选出阳性克隆,采用实时定量PCR和Western blot法检测克隆细胞目的基因和蛋白的表达量,并观察转染后的NIH3T3细胞体外生长状况。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)IP10-EGFRvⅢScFv,经过浓度为200mg/L的G418工作液筛选出了稳定高表达IP10-EGFRvⅢScFv的细胞系NIH3T3,且其生长状态并未受转染基因的影响。通过荧光检测、实时定量PCR、Western blot法检测到转染72h后目的基因和蛋白表达量最高,和稳定克隆株相比,表达量并无明显差异(P>0.05)。结论构建的新型细胞因子融合蛋白可以在NIH3T3细胞内获得稳定表达,为后期融合蛋白的提取及功能研究打下基础。 展开更多
关键词 表皮生长因子受体 γ干扰素诱导蛋白10 单链抗体 融合蛋白 构建 表达
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pGEX-e23(scFv) PE40融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达(英文) 被引量:1
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作者 王慧 韩苇 +1 位作者 颜真 张英起 《第四军医大学学报》 北大核心 2001年第7期580-583,共4页
目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因 c- erb B- 2表达产物 p185的单链抗体 e2 3(sc Fv) /假单孢菌属外毒素活性片段 PE40免疫毒素的融合蛋白 ,为乳腺癌、胃癌等多种 c- erb B-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础 .方法 去除克隆... 目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因 c- erb B- 2表达产物 p185的单链抗体 e2 3(sc Fv) /假单孢菌属外毒素活性片段 PE40免疫毒素的融合蛋白 ,为乳腺癌、胃癌等多种 c- erb B-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础 .方法 去除克隆在真核表达载体 p L NCX中的 e2 3 (sc Fv) PE40基因 5′端编码信号肽的核苷酸序列 ,并将改建后的融合基因克隆到原核融合表达载体 p GEX- 4T中表达 .结果 序列测定表明 .改建后的抗 p185 e2 3(sc Fv) /PE40序列正确 .融合基因经IPTG诱导表达 4h后 ,经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,在Mr90 0 0 0处出现一条新生蛋白带 ,表达量约占菌体总蛋白的15 % .结论 成功改建并在原核中表达了抗 p185 e2 3(sc Fv) /PE40融合蛋白 . 展开更多
关键词 单链抗体 免疫毒素 基因表达 pEGX-e23 PE40融合基因
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人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定 被引量:2
6
作者 熊颖 李晓进 +3 位作者 乔玉玲 毛晓燕 龟井优德 赵红 《微生物学免疫学进展》 2009年第4期4-7,共4页
实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,... 实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6。以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体。具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值。 展开更多
关键词 单链抗体 原核表达 中和活性
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抗人肝癌MDscFV基因的表达及其免疫活性初步研究 被引量:1
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作者 陆东东 张锡然 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2003年第5期302-303,共2页
将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组,并使其表达。采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建加MDscFV基因,经过常规转化与筛选,诱导表达蛋白。MDscFV基因全长为7... 将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组,并使其表达。采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建加MDscFV基因,经过常规转化与筛选,诱导表达蛋白。MDscFV基因全长为732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。重组蛋白相对分子量36kDa。scFV保留了与亲本抗体MD相似的免疫活性。成功地构建了抗人单链抗体MDscFV,并获得了较高水平的功能性表达。 展开更多
关键词 人肝癌 MDscfv基因 基因表达 免疫活性 基因重组 单克隆抗体MD
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C端带His标签重组ScFv真核表达载体的构建及鉴定 被引量:1
8
作者 赖德华 沈粤春 +3 位作者 赵超尘 吴阳 王晓明 李君 《广州医学院学报》 2013年第5期13-16,共4页
目的:构建表达抗p185且含His标签的ScFv的真核表达载体。方法:通过PCR自pcDNAH520C9ScFv-hIL-2质粒中获得H520C9ScFv片段,将此片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中;设计引物在ScFv片段C端增加His标签和凝血酶识别序列,再与质粒pcDNA3.1(+... 目的:构建表达抗p185且含His标签的ScFv的真核表达载体。方法:通过PCR自pcDNAH520C9ScFv-hIL-2质粒中获得H520C9ScFv片段,将此片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中;设计引物在ScFv片段C端增加His标签和凝血酶识别序列,再与质粒pcDNA3.1(+)连接,将所得的融合基因进行限制性内切酶EcoR I、HindⅢ双酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定,并测定目的序列。结果:成功将H5200C9ScFv片段、His标签和凝血酶识别序列插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-His-ScFv,为下一步在真核细胞中表达和纯化抗p185单抗奠定基础。 展开更多
关键词 载体构建 His标签 融合基因 乳腺肿瘤
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抗乙型肝炎表面抗原单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及鉴定
9
作者 雷清 刘鹏 +1 位作者 郭敏 蒋琳 《微生物学免疫学进展》 2008年第4期36-39,共4页
从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E.coli... 从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E.coli中表达,得到一约30kD的外源蛋白;纯化后经ELISA检测与HBsAg有较高的亲和力活性,为下一步的人源化改造奠定了基础。 展开更多
关键词 单链抗体 连接肽 基因表达
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HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析 被引量:2
10
作者 杨雄 刘秀侠 +2 位作者 南昊 许晓东 陈红英 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2014年第5期205-210,216,共7页
【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结... 【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。 展开更多
关键词 HIV-1 单链抗体 B12 载体构建 亲和纯化 抗原结合活性
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抗α毒素1D5单抗ScFv基因表达菌株生物学活性的研究 被引量:1
11
作者 许崇利 许崇波 林一民 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS 北大核心 2019年第2期47-53,共7页
为研究抗α型魏氏梭菌α毒素ScFv蛋白的生物学功能,利用PCR技术克隆抗α毒素1D5单抗的ScFw基因,构建含SCFQ基因表达质粒pHOG-lD5的重组表达菌株XL1-BLUE(pHOG-lD5)。酶切鉴定和序列分析证实构建的PHOG-1D5重组表达质粒含有ScFw基因,且... 为研究抗α型魏氏梭菌α毒素ScFv蛋白的生物学功能,利用PCR技术克隆抗α毒素1D5单抗的ScFw基因,构建含SCFQ基因表达质粒pHOG-lD5的重组表达菌株XL1-BLUE(pHOG-lD5)。酶切鉴定和序列分析证实构建的PHOG-1D5重组表达质粒含有ScFw基因,且基因序列和阅读框架正确。ELISα检测结果表明在重组菌株XL1-BLUE(PHOG-1D5)培养上清和细胞周质中均检测到目的蛋白。SDS-PαGE分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的29.2%。同时对ScFv蛋白生物学活性进行检测,结果表明其能中和α毒素的卵磷脂酶活性且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用,从而为临床治疗α毒素中毒奠定了坚实基础。 展开更多
关键词 α毒素 ScFw基因 表达 生物学活性
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抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达 被引量:10
12
作者 邵长利 史利军 +4 位作者 姚站馨 王宏业 吕茂民 刘明 章金刚 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期238-242,共5页
目的克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达。方法从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E8中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗... 目的克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达。方法从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E8中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Western blotting对目的蛋白进行鉴定,间接ELISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性。结果克隆的VH基因长度为351bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr32000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争ELISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性。结论成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础。 展开更多
关键词 红细胞 H抗原 单链抗体 原核表达
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文) 被引量:7
13
作者 赵宝华 许崇波 +2 位作者 边艳青 段相林 朱平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期690-697,共8页
应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体... 应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 。 展开更多
关键词 单链抗体小分子 基因克隆 表达 生物学活性 Α毒素 A型产气荚膜梭菌
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抗人CD3改形单链抗体的构建、表达及活性测定 被引量:3
14
作者 蒋欣 俞小淙 +6 位作者 刘喜富 张卫国 黄浩旻 林晴 孙健 陈润生 黄华梁 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2000年第9期762-771,共10页
CD3单抗通过多种途径有效地影响机体的免疫状态,在临床应用中具有极大的潜力。为克服鼠源单抗用于临床的局限性,拟采用抗体工程技术研制抗人CD3改形单链抗体。首先,将鼠源CD3单抗OKT3轻重链CDRs分别移植到人源抗体LS1轻链和Nd重链的... CD3单抗通过多种途径有效地影响机体的免疫状态,在临床应用中具有极大的潜力。为克服鼠源单抗用于临床的局限性,拟采用抗体工程技术研制抗人CD3改形单链抗体。首先,将鼠源CD3单抗OKT3轻重链CDRs分别移植到人源抗体LS1轻链和Nd重链的框架中,经计算机模拟其空间构象,进行残基替换,确定CD3改形VL、VH_氨基酸序列,化学合成改形VL、VH_基因,将其分别插入至载体pROH80中,构建成抗人CD3改形单链抗体(scFv)基因。再将scFv基因克隆至构建的表达载体pALM中诱导表达,产物主要为包涵体。对包涵体进行变性和复性,用IMAC法纯化,FACS法测定CD3改形scFv与抗原的结合活性,显示其竞争抑制率为18%。 展开更多
关键词 CD3 改形抗体 表达载体 构建
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人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定 被引量:5
15
作者 徐重新 张存政 +3 位作者 张霄 刘媛 黄鹰 刘贤金 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期47-52,共6页
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立... 利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5~5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。 展开更多
关键词 Cry1B毒素蛋白 单链抗体 可溶性表达 抗原结合活性
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抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达 被引量:2
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作者 张平 蔡美英 +3 位作者 赵宗蓉 魏大鹏 黎光 毕建虹 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期20-23,共4页
目的 构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法 用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PC... 目的 构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法 用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a+ )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果 获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论 我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 。 展开更多
关键词 scfv基因 构建和表达 scfv活性
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达 被引量:4
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作者 赵宝华 许崇波 +1 位作者 冯书章 朱平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期367-370,共4页
将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至... 将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭菌 Α毒素 单链抗体 基因表达
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西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析 被引量:2
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作者 王俊平 张伟伟 +3 位作者 杜欣军 吴懿娜 董峰 王硕 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期161-164,共4页
利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列(Gly4Ser)3,利用重叠延伸PCR... 利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列(Gly4Ser)3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段(scFv),亚克隆至原核表达载体pET30a(+),并转化感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。 展开更多
关键词 西维因 单链抗体 克隆 表达 活性
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两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达 被引量:3
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作者 刘志刚 俞炜源 王翔 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期514-516,共3页
By using PCR and DNA recombination,two fusion genes of humanized mouse anti human fibrin scFv and low molecular weight single chain urokinase (Scu PA 32K)was constructed.The difference of these two fusion genes lay in... By using PCR and DNA recombination,two fusion genes of humanized mouse anti human fibrin scFv and low molecular weight single chain urokinase (Scu PA 32K)was constructed.The difference of these two fusion genes lay in the linker between two moieties,one was (Ala) 3 and another was (Gly 4Ser) 3.These two fusion genes were both overexpressed in E.coli with the expression level at 30%.Both expression products showed the activity of binding antigen D Dimer and activating plasminogen after the denaturation and renaturation,but under general refolding conditions,the one with linker (Gly 4Ser) 3 showed better effect in the renaturation of fusion protein. 展开更多
关键词 单链抗体 尿激酶 融合基因 连接肽 基因表达
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抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达 被引量:2
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作者 王承民 初冬 +7 位作者 秦建华 刘丽艳 魏刚才 谢红兵 齐永华 王三虎 吴艳云 何宏轩 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期207-211,共5页
应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载... 应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a(+)载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应. 展开更多
关键词 堆型艾美耳球虫 子孢子 单链抗体 基因克隆 表达
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