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抗人P185^(erbB2) scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞 被引量:2
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作者 王军 张玲 +6 位作者 顾洪涛 郭宁 施明 沈倍奋 毛海婷 李翠玲 温培娥 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第6期412-416,共5页
目的将抗人P185erbB2scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC),通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。方法MTT法检测细胞增... 目的将抗人P185erbB2scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC),通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。方法MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RT-PCR检测细胞穿孔素表达水平。结果HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%(P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%(P<0.01);CD25、LFA-1、FasL表达水平分别由3·99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%16.19%(P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高(P<0.01)。结论HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA-1/ICAM-1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。 展开更多
关键词 ERBB2 P185erbB2scfv—fc—IL-2融合蛋白 卵巢癌 免疫细胞因子 杀伤活性
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全人源scFv-Fc真核表达载体的构建与鉴定 被引量:2
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作者 叶迎春 年四季 +3 位作者 刘佳佳 王栩 高燕 袁青 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期226-229,共4页
目的:构建全人源抗IL-33 scFv-Fc重组载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),表达并鉴定融合抗体蛋白。方法:RT-PCR扩增人IgG1 Fc段并插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1/Fc重组载体;将合成的信号肽(SP)序... 目的:构建全人源抗IL-33 scFv-Fc重组载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),表达并鉴定融合抗体蛋白。方法:RT-PCR扩增人IgG1 Fc段并插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1/Fc重组载体;将合成的信号肽(SP)序列插入重组质粒pcDNA3.1/Fc,构建重组pcDNA3.1/SP-Fc通用载体;最后将本实验室前期筛选的抗IL-33 scFv插入重组质粒pcDNA3.1/SP-Fc中,构建重组pcDNA3.1/SP-scFv-Fc载体,测序正确后转染CHO细胞。RT-PCR、Western blot检测目的基因的转录及表达。结果:重组质粒测序结果表明成功地构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,插入的SP-scFv-Fc目的基因大小为1 560 bp左右。转染CHO细胞后,RT-PCR结果显示目的基因在CHO细胞中成功转录,Western blot显示表达的蛋白可以和羊抗人IgG1 Fc抗血清发生特异性免疫反应。结论:成功构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,以便于后续在CHO细胞中表达。 展开更多
关键词 scfv-fc CHO细胞 真核表达 IL-33
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全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析 被引量:2
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作者 高畅 张倩倩 +4 位作者 熊四平 唐小军 仇镇宁 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期741-744,749,共5页
目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性。方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体。以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性... 目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性。方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体。以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000。纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 全人源 scfv-fc抗体
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Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究
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作者 曹经瑗 DeJaeger Geert +6 位作者 李川 孟庆玲 Terryn Nancy Depicker Ann 毕胜利 李德新 梁米芳 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期343-348,共6页
为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcH... 为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv-FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv-FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区(scFv)与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。 展开更多
关键词 甲型肝炎病毒 人源基因工程抗体 scfv-fc融合抗体 酵母细胞表达系统
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全人源抗IL-33scFv-IgG1Fc融合蛋白在CHO k1细胞中稳定高表达
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作者 叶迎春 年四季 +3 位作者 王栩 吴桐 徐文峰 袁青 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期600-603,609,共5页
目的利用两种不同真核表达载体构建全人源抗白细胞介素33单链抗体c片段(IL-33 sc Fv-Fc)重组载体,转染中国仓鼠卵巢(CHO)k1细胞,筛选稳定高表达单细胞株以提高融合蛋白产量。方法双酶切前期构建的重组质粒pc DNA3.1/SPsc Fv-Fc,回收SP-s... 目的利用两种不同真核表达载体构建全人源抗白细胞介素33单链抗体c片段(IL-33 sc Fv-Fc)重组载体,转染中国仓鼠卵巢(CHO)k1细胞,筛选稳定高表达单细胞株以提高融合蛋白产量。方法双酶切前期构建的重组质粒pc DNA3.1/SPsc Fv-Fc,回收SP-sc Fv-Fc片段,插入载体PMH3EN中,构建PMH3EN/SP-sc Fv-Fc重组载体并与重组质粒pc DNA3.1/SP-sc Fv-Fc分别转染CHO k1细胞;反转录PCR、Western blot法检测目的基因sc Fv-Fc的转录及表达;Dot blot法筛选稳定高表达细胞株;ELISA检测sc Fv-Fc的水平及生物学活性。结果重组质粒测序结果表明成功构建了真核表达载体PMH3EN/SP-sc Fv-Fc,插入目的基因SP-sc Fv-Fc大小为1560 bp左右。反转录PCR检测重组质粒表达情况显示两组重组质粒的目的基因在CHO k1细胞中均成功转录。sc Fv-Fc不仅可分泌到细胞培养基中,还可与人IL-33以及抗人Ig G1 Fc特异性结合。重组载体PMH3EN/SP-sc Fv-Fc组融合蛋白表达水平相对较高。经过4轮筛选,选出了稳定高表达细胞株,初步测其sc Fv-Fc表达产量为10 mg/L;竞争ELISA检测结果显示sc Fv-Fc可显著抑制IL-33与其受体ST2的结合。结论在CHO k1细胞成功高表达IL-33 sc Fv-Fc。 展开更多
关键词 白细胞介素33 单链抗体c片段(sc Fv-fc) CHO k1细胞 表达载体
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重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化
6
作者 王丁丁 苏曼曼 +2 位作者 胡丽莉 袁丽颖 颜炜群 《现代生物医学进展》 CAS 2011年第16期3048-3051,共4页
目的:研究重组人小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv-Fc的纯化方法。方法:分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合protein A亲和层析柱,对Sc... 目的:研究重组人小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv-Fc的纯化方法。方法:分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合protein A亲和层析柱,对ScFv-Fc的纯化方法进行了研究。结果:确定ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH5.2的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h。经过protein A亲和层析柱纯化后,ScFv-Fc纯度可达94%以上。结论:确定了ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。 展开更多
关键词 scfv—fc 表达 毕赤酵母 发酵优化 纯化
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一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建 被引量:2
7
作者 王丁丁 苏曼曼 +4 位作者 胡丽莉 袁丽颖 孙艳 汪炬 颜炜群 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期110-117,共8页
为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小... 为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小分子抗体ScFv-Fc的ScFv区自由替换的限制性酶切位点。分别扩增人抗狂犬病毒以及抗乙型肝炎表面抗原的ScFv片段,克隆至已构建的通用载体pPICZα/Fc,在毕赤酵母中诱导表达。进一步在1L条件下对活性抗体进行发酵,并利用proteinA亲和层析柱进行纯化。应用酵母基因组PCR、ELISA、Western blotting、活性检测等试验对此小分子抗体的表达进行生物学及免疫学分析。结果表明具有狂犬病毒抗原结合活性以及乙肝表面抗原结合活性的人源抗体分子均获得成功表达,1L发酵条件下表达量达到20~30mg/L,protein A亲和层析纯化后纯度>95%。研究构建了可用于功能性抗体分子ScFv-Fc筛选和表达的通用载体并对其发酵、纯化条件进行了摸索,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。 展开更多
关键词 融合抗体 scfv-fc 通用载体 表达 毕赤酵母
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抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达 被引量:4
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作者 杨艳丽 张娟 +3 位作者 何远 李海鑫 李桉栋 王旻 《药物生物技术》 CAS CSCD 2011年第3期206-210,共5页
目前报道的靶向VEGF/VEGFR基因工程抗体多为不含Fc片段的Fabs、cFv等小分子抗体,该文旨在CHO-k细胞中表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体。将抗VEGFR-2 scFv(AK404)基因与含有人IgG1恒定区的真核表达载体pcDNA3.1-Fc连接,重组质粒测序后经... 目前报道的靶向VEGF/VEGFR基因工程抗体多为不含Fc片段的Fabs、cFv等小分子抗体,该文旨在CHO-k细胞中表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体。将抗VEGFR-2 scFv(AK404)基因与含有人IgG1恒定区的真核表达载体pcDNA3.1-Fc连接,重组质粒测序后经脂质体介导转染CHO-k细胞,G418加压筛选获取稳定表达细胞株。RT-PCR、western blot检测目的基因的转录、表达。测序结果表明重组质粒构建成功,RT-PCR及western blot显示目的基因成功整合到宿主基因组并表达。最终获得可稳定表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的重组CHO-k细胞株,为融合抗体的大量制备和活性研究打下基础。 展开更多
关键词 VEGFR-2 scfv-fc融合抗体 抗肿瘤血管生成
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Binding Activity Difference of Anti-CD20 scFv-Fc Fusion Protein Derived from Variable Domain Exchange 被引量:13
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作者 Shusheng Geng Jiannan Feng +7 位作者 Yan Li Yingxun Sun Xin Gu Ying Huang Yugang Wang Xianjiang Kang Hong Chang Beifen Shen 《Cellular & Molecular Immunology》 SCIE CAS CSCD 2006年第6期439-443,共5页
Two novel engineered antibody fragments binding to antigen CD20 were generated by fusing a murine IgM-type anti-CD20 singie-chain Fv fragment (scFv) to the human IgG1 CH2 (i.e., Cγ2) and CH3 (i.e., Cγ3) domain... Two novel engineered antibody fragments binding to antigen CD20 were generated by fusing a murine IgM-type anti-CD20 singie-chain Fv fragment (scFv) to the human IgG1 CH2 (i.e., Cγ2) and CH3 (i.e., Cγ3) domains with the human IgG1 hinge (i.e. Hγ). Given the relationship between structure and function of protein, the 3-D structures of the two engineered antibody fragments were modeled using computer-aided homology modeling method. Furthermore, the relationship between 3-D conformation and their binding activity was evaluated theoretically. Due to the change of active pocket formed by CDRs, the HL23 (VH-Linker-VL-Hγ-Cγ2-Cγ3) remained its activity because of its preserved conformation, while the binding activity of the LH23 (VL-Linker-VH-Hγ-Cγ2-Cγ3) was impaired severely. Experimental studies by flow cytometry and fluorescence microscopy showed that HL23 possessed significantly superior binding activity to CD20-expressing target cells than LH23. That is to say, the order of variable regions could influence the binding activity of the fusion protein to CD20^+ cell lines, which was in accordance with the theoretical results. The study highlights the potential relationship between the antibody binding activity and their 3-D conformation, which appears to be worthwhile in providing direction for future antibody design of recombinant antibody. 展开更多
关键词 binding activity scfv-fc variable domain exchange molecular modeling
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抗IL-33全人源scFv-Fc抗体的可溶性表达与鉴定 被引量:1
10
作者 王栩 袁青 +4 位作者 叶迎春 于红 徐文峰 杨燕 年四季 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期462-465,共4页
通过对通用型在细菌中可溶性表达scFv-Fc抗体载体的构建,对抗IL-33全人源scFv-Fc抗体进行可溶性表达并鉴定。扩增人IgG1Fc片段及前期筛选的抗IL-33单链抗体(scFv)DNA,分别插入到改建的载体pLZ16中,构建可溶性重组表达pLZ16-scFv-Fc质粒... 通过对通用型在细菌中可溶性表达scFv-Fc抗体载体的构建,对抗IL-33全人源scFv-Fc抗体进行可溶性表达并鉴定。扩增人IgG1Fc片段及前期筛选的抗IL-33单链抗体(scFv)DNA,分别插入到改建的载体pLZ16中,构建可溶性重组表达pLZ16-scFv-Fc质粒。将重组质粒转入E.coli DH5αF’,菌落经PCR和测序验证表明我们成功构建了pLZ16-scFv-Fc重组质粒。将阳性克隆子分别于32℃IPTG表达5h或25℃无IPTG表达50h,用HRP标记抗人IgG1Fc抗体进行检测,结果显示25℃无IPTG表达50h时,表达蛋白分泌在细菌周质间,可明显检测到scFv-Fc的可溶性表达;western blotting结果显示,25℃无IPTG表达的scFv-Fc为65kD左右,其可溶性表达量较32℃表达量高。本研究成功构建了pLZ16-scFv-Fc重组质粒,并在E.coli DH5αF’中成功可溶性表达抗IL-33全人源scFv-Fc抗体。 展开更多
关键词 scfv-fc IL-33 可溶性表达
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抗H3N2亚型犬流感病毒重组犬源化抗体的制备及特性分析
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作者 韩德敏 赵丹 +1 位作者 李思宇 刘永杰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期484-492,共9页
由于异源抗体在宠物临床治疗中易引起宿主免疫排斥反应,因此制备基于本动物源的基因工程抗体显示了更大的发展优势和前景。为制备H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)的重组犬源化抗体scFv-Fc,采集CIV感染犬外周血淋巴细胞... 由于异源抗体在宠物临床治疗中易引起宿主免疫排斥反应,因此制备基于本动物源的基因工程抗体显示了更大的发展优势和前景。为制备H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)的重组犬源化抗体scFv-Fc,采集CIV感染犬外周血淋巴细胞提取总RNA,利用PCR技术扩增IgG重链(VH)、轻链(VL)和Fc片段。利用重叠延伸PCR将VH和VL通过弹性肽链linker连接成单链抗体(scFv)片段,并转化大肠杆菌,挑取阳性菌测序。经分析筛选后,将目标scFv与Fc片段链接,构建scFv-Fc重组犬源抗体片段。经诱导表达,获得分子量约为50 kD的scFv和约为89 kD的重组抗体scFv-Fc。抗体活性测定结果表明,scFv能与CIV特异性结合,1 mg/mL scFv的ELISA效价为1∶210,血凝抑制(HI)效价为1∶27,中和抗体效价为1∶20。1 mg/mL scFv-Fc的HI效价为1∶26,ELISA效价1∶25,中和抗体效价为1∶20。本研究成功制备了针对H3N2亚型犬流感病毒的重组犬源scFv-Fc,为该病毒感染的治疗提供了物质基础。 展开更多
关键词 犬流感病毒 单链抗体scfv 重组抗体scfv-fc 免疫学活性
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