Generation and analysis of 113 adult stage Schistosoma japonicum (Chinese strain) expressed sequence tags

To rapidly and economically obtain knowledge about adult stage Schistosoma japonicum (Chinese strain) expressed genes using expressed sequence tag (EST) Methods A directional cDNA library constructed from Schistosoma japonicum (Chinese strain ) adult stage RNA was used to generate expressed sequence tags(ESTs) These were compared against an EMBL parasites database and GENBANK database by BLASTn and BLASTx Results A total of 314 phage clones were randomly selected for generating expressed sequence tags(ESTs) From these clones, 132 EST quality sequence were obtained Among these EST quality sequences,113 ESTs were successfully submitted to the dbEST at GenBanK A total of 7 6% of these EST quality sequences were previously identified sequence of Schistosoma japonicum, while 4 5% were putatively identified sequences of Schistosoma japonicum A total of 23 5% of these EST quality sequences were putatively identified sequence of Schistosoma mansoni or other organisms 57 6% had no matches in the database and were classified as unknown sequences Most ESTs with the putative protein identified belonged to housekeeping proteins Information about several interesting genes was found Conclusion Partial cDNA sequencing to generate expressed sequence tags (ESTs) has the potential to rapidly and economically increase our knowledge about adult stage Schistosoma japonicum(Chinese strain) expressed genes

中国大陆日本血吸虫品系的研究 Ⅰ.幼虫-钉螺的相容性

本文进行了安徽贵池、湖北监利、广西桂平、四川天全、云南洱源及福建福清6地日本血吸虫和钉螺的人工交互感染实验。结果表明各地日本血吸虫与钉螺呈现不同的相容性。湖北、安徽两地的血吸虫幼虫与钉螺的相容性无差别。湖北、安徽两地血吸虫幼虫很难在云南、四川两地钉螺体内发育成熟逸出尾蚴:反之,云南、四川两地血吸虫幼虫与湖北、安徽两地钉螺却可相容。广西的血吸虫幼虫或钉螺与安徽的钉螺或幼虫亦可交互感染而相容,但尾蚴逸出前期均较感染本地钉螺的为长;广西的血吸虫幼虫与四川、云南、福建的钉螺并不相容。福建的钉螺与安徽、云南两地血吸虫幼虫均可相容。本文还提出了在研究日本血吸虫与钉螺的相容性时,必须包括逸出尾蚴的钉螺感染率和尾蚴逸出前期的数据,才能正确评价两者的相互关系。

日本血吸虫23kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的 研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法 分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果 联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %

日本血吸虫中国大陆株28kDa GST基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌ＴＢ１中表达合日本血吸虫中国大陆株２８ｋＤｅ抗原基因的重组质粒，表达产物是融 合蛋白，分子量为３３ｋＤａ。采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化表达产物。２、４－二硝基氯苯／谷胱 甘肽分光光度测定法和琼脂糖－淀粉凝胶电泳显示重组抗原具有较高的谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ） 活力。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）结果表明该重组抗原可检测到重组２８ｋＤａ ＧＳＴ或日本血吸虫 虫体ＧＳＴ免疫绵羊血清中的特异性抗体；免疫印迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析揭示重组抗原的 ３３ｋＤａ抗原分子能被这两种免疫血清识别，证明它具有ＧＳＴ抗原性。

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjC FABP)核酸疫苗诱导小鼠免疫保护作用研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白分子 (Sj C FABP)核酸疫苗对 BALB/c小鼠的免疫保护性作用。方法 根据 Sj C2 1.7分子基因序列合成 1对特异性引物 P1和 P2 ,并使其5’端分别带有 Bam H1、Xho1的酶切位点序列 ,采用 PCR方法从重组质粒 Sj C FABP-p UC19中扩增出特异性目的基因的开放阅读框序列 ,并在其翻译起始密码子处引入 Kozark序列。限制性酶切后的基因片段被亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3 .1中 ,构建成重组真核表达质粒 Sj C FABP-pc D-NA3 .1,大量制备纯化的重组真核表达质粒。 48只 BAL B/c小鼠分为对照组、实验组、加强组。对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 0μg质粒 pc DNA3 .1DNA,实验组以同样的方式注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-pc DNA3 .1DNA,加强组除注射 10 0μg重组质粒 Sj C FABP-PCDNA3 .1DNA外 ,同时注射 P3 5 -pc DNA3 .1,P40 -pc DNA重组质粒各 10 0μg。每隔 2周免疫 1次 ,共免疫3次。第 3次免疫后的第 3 0天每只小鼠经腹部皮肤感染 (4 5± 1)条尾蚴 ,45 d后剖杀 ,计数各组小鼠肝虫卵数及成虫数。于免疫前及末次免疫后 2周分别经尾静脉采血 ,测定抗体水平。在第 2次免疫后第 10天各组取 2只小鼠处死 ,取股四头肌进行免疫组化分析。结果 免疫组化分析显示实?

日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗对猪保护性免疫作用研究

目的 探讨日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 (Sj CTPI) DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用。方法 分别构建并制备 pc DNA 3.1- Sj CTPI DNA疫苗及 pc DNA3.1- P35和 P40 (IL - 12的两个亚单位 )的 DNA疫苗。取上海松江本地猪 (自幼阉割 ) 30头 ,分为 A、B、C 3组 ,每组 10头。 A组 (TPI组 )每头猪于两侧臂部肌肉注射 5 0 0 μg Sj CTPI DNA疫苗 ;B组 (TPI+IL- 12组 )每头猪肌肉注射 5 0 0 μg Sj CTPI DNA及 5 0 0 μg P35 DNA疫苗、5 0 0 μg P40 DNA疫苗。C组 (对照组 )每头猪肌肉注射 5 0 0 μg pc DNA3.1质粒 DNA。共免疫 3次 ,每次间歇 3周。末次免疫后 30 d,每猪攻击 6 0 0条日本血吸虫尾蚴 (背部贴片法 )。攻击后 45 d剖杀 ,经胸主动脉灌注 ,并从门静脉处收集成虫计数。从肝脏上同一部位切下小块肝组织 ,置 5 % KOH内溶解 ,后计算每克虫卵数。比较各组间的减虫率、减雌率和减卵率。在免疫前、末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血 ,分离血清 ,用 EL ISA法测抗体。结果 TPI组和 TPI+IL- 12组与质粒对照组相比 ,分别获得 48.3%和 46 .2 %的减虫率 ,5 3.6 %和5 9.6 %的减雌率 ,49.4%和 6 5 .8%的减卵率。TPI组的 10头猪中有 6头在免疫后可检出抗 r Sj CTPI抗体 ,TPI+IL- 12组 10头猪中有

感染亚洲不同地域品系日本血吸虫小鼠的肝虫卵肉芽肿大小

目的 :了解亚洲不同地域品系日本血吸虫对宿主的致病性。方法 :应用相同宿主 C57BL小鼠在同等条件下感染亚洲 7地域品系日本血吸虫后 ,观察和比较其肝虫卵肉芽肿体积大小。结果 :虽然不同地域品系日本血吸虫对小鼠肝组织所致的虫卵肉芽肿体积大小有异 ,但以亲动物的中国台湾品系所致的单个卵的增生期虫卵肉芽肿平均体积为最小。它与亲人体的中国云南、中国广西、中国四川、中国皖鄂、日本、菲律宾 6地品系所致的增生期虫卵肉芽肿平均体积具有显著性的差别。结论 :中国台湾品系日本血吸虫尾蚴感染宿主后 ,寄生虫与宿主的相互关系可能具有某些独特性 ,或存在免疫应答程度上的差异。

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 DNA疫苗诱导 C5 7BL /6小鼠的保护性免疫作用。方法 分别以 p U C19- Sj CTPI和 pc DNA1.1- IL - 12为模板设计引物 ,将 PCR扩增到的Sj CTPI基因以及 IL - 12的亚单位 P35 和 P40 基因克隆到真核表达载体 pc DNA .3.1中。大量制备 pc D-NA3.1- Sj CTPI和 pc DNA 3.1- P35 、pc DNA3.1- P40 的质粒 DNA。把 45只 5～ 6周龄 C5 7BL /6小鼠分成 3组 ,对照组 (pc DNA组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA3.1;实验组 (TPI组 )肌肉注射 10 0μg的pc DNA3. 1- Sj CTPI;加强组 (TPI+ IL - 12组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA 3.1- Sj CTPI及 10 0μg的pc DNA3.1- P35 和 pc DNA3.1- P40 的混合物 ,分别于第 1、5周各免疫 1次 ,第 9周每鼠用 45条尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫、肝内虫卵。采用免疫组化法检测 Sj CTPI在局部肌组织内的表达 ,用脾细胞培养法检测特异性抗原刺激后的 IL - 2、IL - 4、IL - 10、IFN-γ在攻击前后的水平。分别于 2次免疫前和攻击前及攻击后 2周经尾静脉采血 ,分别采用 EL ISA和 Western- blot检测血清中抗 TPI抗体。结果 Sj CTPI可在 C5 7BL /6小鼠骨骼肌细胞膜、细胞浆中得到表达。细胞因子 IL -2的水平在攻击前、后 。

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。

中国大陆日本血吸虫品系的研究——Ⅵ.多位点酶电泳分析

本文对中国大陆的安徽、湖北、广西、四川、云南5地日本血吸虫的自然隔离群体进行了多位点酶电泳分析。检测了GDH、G6PD、LDH、MDH、PGI、PGM、SOD 7种同工酶的9个基因位点,其中LDH-1、LDH-2、MDH和PGM位点存在两个以上不同等位基因。结果显示多态位点所占的比例为44.4％,说明在大陆境内日本血吸虫的自然隔离群体中存在着不同程度的遗传多态现象。

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

目的 运用表达序列标签 (ExpressedSequenceTag ,EST)技术快速、经济地发现日本血吸虫 (中国大陆株 )新基因。方法 随机挑取日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST ,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析。结果 本研究共随机挑取日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫cDNA文库单个重组克隆 2 0 0个 ,获得了 76个有EST价值的序列 ,其中 7.9%为日本血吸虫已知序列 ,5 .3 %为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的 2 2 .4 % ,未知序列占 5 9.2 %。在获得的76个有EST价值的序列中 ,66个成功在GenBankdbEST中登录。通过同源性分析 ,发现了一些令人感兴趣的基因。结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫新基因。

中国大陆日本血吸虫品系的研究——Ⅱ.哺乳动物的易感性

本文报告了6种哺乳动物于人工感染安徽、湖北、广西、四川和云南5地日本血吸虫的虫体回收率及其虫卵开放前期。结果表明,C57BL小鼠、金黄仓鼠、长爪沙鼠、家兔和恒河猴均是中国大陆上述5地日本血吸虫的可容宿主,大鼠则是不可容宿主。各种动物感染大陆上述5地日本血吸虫的虫卵开放前期平均天数表明,C57BL小鼠、金黄仓鼠或恒河猴感染云南或广西两地血吸虫的虫卵开放前期均较四川的为长,差别显著。本文指出德国汉堡热带医学研究院提供的或由其转种而传代的日本血吸虫的平均虫卵开放前期明显地较中国大陆各地日本血吸虫自然隔离群的长5～8d,它已不能代表中国大陆品系日本血吸虫的生物学特性,建议将其称为“中国大陆Vogel品系”,以资与中国大陆的加以区别。

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序， 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ， 逆转录聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） ， 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较， 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ； 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。

日本血吸虫FKBP12基因的原核克隆表达及表达产物的纯化

目的 扩增、原核克隆和表达日本血吸虫 (Sj) FKBP12基因全长 c DNA,并进行表达产物的纯化。方法 从成虫 RNA中 RT- PCR扩增 Sj FKBP12基因完整的编码阅读框后 ,将其克隆入p GEX- 4 T- 1原核表达载体中 ,IPTG诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 将 SjFKBP12基因成功克隆入 p GEX- 4 T- 1表达载体中 ;诱导表达并成功纯化出重组 FKBP12蛋白。结论 成功克隆了 Sj FKBP12基因 ,并表达和纯化得到了 FKBP12蛋白 ,为研究 FKBP12的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础。

日本血吸虫Calpain的DNA疫苗诱导小鼠免疫保护性研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株Calpain的DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护性作用。方法 大量制备pVAC质粒DNA和pVAC -CalpainDNA疫苗 ,Balb/c小鼠 5 0只 ,随机均分为对照组和实验组 ,对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 μgpVAC质粒DNA ,实验组以同样方式注射 10 μgpVAC -CalpainDNA疫苗 ,第 3周加强免疫一次。第 4周每只小鼠经腹部皮肤感染 ( 2 5± 1)条尾蚴 ,感染 6周后剖杀 ,从门静脉灌流收集计成虫数、碎脾计T淋巴细胞总数、从各鼠肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 %KOH溶液消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 ,比较减虫率、减雌率和减卵率。于免疫前、第一次免疫后 2周和感染后 2周分别从尾静脉采血 ,用ELISA测定抗体水平。结果 与对照组相比 ,实验组获得 36.84%的减虫率、36.36%的减雌率和 43.31%的减卵率 ,感染后实验组小鼠IgG抗体水平升高幅度大于对照组 ,对照组T淋巴细胞数显著多于实验组。结论 CalpainDNA疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用 。

日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的分离和EST序列测定

目的 运用表达序列标签技术（ＥＳＴ方法） ，从ＳｊｃＤＮＡ文库中分离、鉴定和测定血吸虫表达基因序列。方法 应用ＥＳＴ方法，从Ｓｊ ｃＤＮＡ 文库中随机挑选出单个重组克隆进行ＰＣＲ直接序列分析，通过互联网将获得的ＥＳＴ 序列送入ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ 进行同源性检索，并将发现的未知基因ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩｄｂＥＳＴ 以获得ＧｅｎＢａｎｋ 进入号。结果 分离了１００ 个Ｓｊ重组克隆，并已对２５ 个克隆ｃＤＮＡ 插入片段的ＰＣＲ 产物进行直接序列分析，获得了２１ 个ＥＳＴ 序列。其中２ 个ＥＳＴ 序列为ＧｅｎＢａｎｋ 中已知的血吸虫基因序列，１９ 个为未知基因序列。这１９ 个ＥＳＴ序列已被ＮＣＢＩｄｂＥＳＴ和ＧｅｎＢａｎｋ 接受并获得了新序列进入号。结论 采用ＥＳＴＰＣＲ直接序列分析方法可大量获得血吸虫表达基因ＥＳＴ序列，为进一步开展日本血吸虫（中国大陆株） 表达基因的研究奠定了基础。

日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

【目的】研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测。【方法】用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中扩增,以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(openreadingframe,ORF);用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测。【结果】用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中获得了亲免素基因5'端和3'端所缺序列,得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1438bp,其ORF长1296bp,编码431个氨基酸。利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列。并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF。【结论】成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础。

微卫星锚定PCR研究日本血吸虫的遗传变异

目的 对中国不同自然隔离群的日本血吸虫进行遗传变异研究 ,并为中国日本血吸虫地域品系的划分提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR -PCR)技术对中国 7省 10地日本血吸虫标本基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物 ,计算遗传距离 ,并构建系统进化树。结果 各地域标本PCR扩增产物均呈多态性 ,其中中国大陆与中国台湾日本血吸虫之间的遗传距离为 0 316± 0 0 6 7(0 176～ 0 378) ;中国大陆日本血吸虫山区型之间的遗传距离为 0 0 6 7;湖区型之间的遗传距离为 0 0 6 3～ 0 176 ;山区型与湖区型之间的遗传距离为 0 0 6 7～ 0 2 5 0 ;湖北省境内 4个地域的日本血吸虫 ,其遗传距离为0 0 6 3～ 0 111。结论 根据我们所采集的日本血吸虫标本和SSR -PCR的实验结果 ,认为中国大陆日本血吸虫在基因分类水平上至少可分为不同层次的 5类 :①云南洱源、四川天全为一类 ;②安徽贵池、湖南岳阳为一类 ;③湖北武汉、湖北钟祥为一类 ;④江西新建、湖北阳新为一类 ;⑤湖北松滋单独为一类。其中①与②③④⑤在总体上可分为两大类 ,②③④⑤又可再分为②③与④⑤两类 ,②③与④⑤还可再各分为两类 ,此外 ,中国台湾日本血吸虫单独列为一类。

中国大陆日本血吸虫品系的研究——Ⅻ.五地隔离群血吸虫DNA杂交

以pSM889为探针,对分布于中国大陆安徽、湖北、广西、云南、四川5地日本血吸虫自然隔离群的雄虫DNA进行了杂交,分析其长度多态性差异。经限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切的杂交图谱分析,结果表明其强杂交带虽相同,但在EcoRI酶切的杂交图谱中,分子量分别在4.4-9.6kb和2.3-4.4kb的上述5地隔离群的弱杂交带上却呈现明显的差别。这表明5地自然隔离群日本血吸虫的DNA结构发生了某些变异,此结果进一步为中国大陆境内日本血吸虫存在品系差别提供了分子生物学的依据。

中国大陆日本血吸虫品系的研究 X.成虫蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

对中国大陆的安徽、湖北、广西、四川和云南5地日本血吸虫成虫蛋白质组分进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和比较,结果表明各地虫体蛋白质电泳图谱基本相似,但作银染分析时,广西地区两性虫体的蛋白条带则呈现某些差别。