日本血吸虫PA28亚单位蛋白的表达与鉴定、纯化及免疫反应性的评价

目的 将亚克隆在pET32a(+)质粒上的日本血吸虫蛋白酶体激活因子PA2 8亚单位基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物用Western -blot及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法 将重组表达质粒 pET32a(+) -PA2 8转化入大肠杆菌BL2 1中 ,IPTG诱导表达后超声裂菌 ,离心后取上清进行SDS -PAGE ,观察融合蛋白的表达情况 ;用Ni-NTA柱子纯化目标蛋白 ;将SDS -PAGE后的蛋白从凝胶转移到PVDF膜上 ,分别用 6 -His抗体、日本血吸虫尾蚴感染 6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹 ,将纯化后的融合蛋白作为包被抗原 ,检测正常兔血清及感染兔血清 ,对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果 重组菌株用IPTG诱导后于 4 8kDa处有一表达条带 ,该蛋白与硫氧还蛋白融合表达 ,带有 6 -His,用抗 6 -His抗体做免疫印迹有特异性的单一反应带 ,用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹 ,结果显示该目的蛋白带与以上多抗具有敏感特异的反应条带。ELISA的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清具有较敏感特异的免疫反应性。结论 PA2 8蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且分子量约为 4 8kDa ,该蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有较敏感特异的免疫反应性。

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。 方法 将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。 结果 重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。 结论 AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 。

日本血吸虫M_r为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的将亚克隆在pET32a(+)质粒上的日本血吸虫Mr为8 000钙结合蛋白(calcium-binding protein, CBP) 基因进行表达及蛋白纯化,并对表达产物用Western blotting 及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法将重组表达质粒pET32a(+)-CBP 转化入宿主菌BL21中,IPTG诱导表达后超声裂菌,离心后取上清进行SDS-PAGE,观察融合蛋白的表达情况;用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白;将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上,分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹,将纯化后的融合蛋白作为包被抗原,ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清,对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29 000处有一表达条带,该蛋白与硫氧还蛋白融合表达,带有6-His基团, 用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带,而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现,ELISA 的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29 000,该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性。