转cry1 Ac/sck基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价

以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4(对照:MH86)及其杂交稻KF6-304(对照:Ⅱ-YM86)为材料,系统地研究了转基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性。结果表明:在群落水平上,转基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响,但在生长中期转基因稻可降低稻田寄生蜂的个体数量。按寄生蜂功能团分析,MSA与MSA4在水稻生长发育的后期初始,提高卵寄生蜂的数量,MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304显著降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量,对其他寄生蜂无明显负面影响。

转SCK基因水稻后代农艺性状变异的研究

研究了转 SCK水稻及其对照栽培后的各项农艺性状的变化。对转基因水稻及其对照的生育期、主茎叶数、株高、剑叶长、剑叶宽、穗数、穗长、穗粒数、穗实粒数、千粒重、着粒密度等农艺性状进行了研究。结果表明 :与对照相比 ,转基因水稻植株都在 1个或多个农艺性状上发生不同程度的变异 ,其中株高均趋向矮化 ,穗数增加 ,其它性状变异的方向和幅度并不一致 ,如转 SCK的 C1 62的穗粒数、实粒数及千粒重都明显少于对照 ;转 SCK的 R5 2 7和 M81结实率下降 ;转 SCK的 O2 42 8的实粒数、结实率和千粒重增加 ;转 SCK的 D62实粒数。

转基因水稻中外源sck基因的遗传表达特性

利用转sck基因高代稳定水稻亲本和组合为材料,研究了外源sck基因的遗传表达特性。结果表明:外源sck和hpt基因都能自交连锁稳定遗传到T11并表达,且连锁基因和表达活性可杂交转移到不育系和杂交组合中,外源sck基因在杂种F2代以单基因显性遗传3:1的模式进行分离,但也出现自交hpt基因丢失,杂交hpt基因甚至sck基因未获得成功转移的现象。田间抗虫性观测表明,转sck基因水稻对钻蛀性螟虫抗性不足,对卷叶螟具有一定抑制作用。外源sck基因在转化或杂交转育的亲本及组合中均获得表达,且具有一定的空间分布特性和基因累加效应,基本为叶片的表达活性高于叶鞘。

转Cry1Ac/Sck基因大米的免疫毒理学评价

为观察转Cry1Ac/Sck基因大米对小鼠免疫功能的影响,将BALB/c小鼠按体重分为4组,即转基因大米组、非转基因大米对照组、AIN93G饲料正常对照组和阳性对照组,相应饲料喂养30d,比较各组小鼠免疫功能改变情况。结果显示,转基因大米组血小板数量显著低于非转基因大米对照组,但是与正常对照组无显著性差异,并且这3组血小板数量均在正常变化范围内;其他观察指标转基因大米组与非转基因大米组相比均无显著性差异;阳性对照组的各项指标,绝大多数均显著低于其他3组。表明转Cry1Ac/Sck基因大米对小鼠免疫功能的影响与非转基因亲本大米基本相同,未对小鼠免疫功能产生不良影响,因此转Cry1Ac/Sck基因大米在小鼠免疫毒理学方面的评价是安全的。

转SCK基因水稻田间抗虫性评价

用转sck基因的M81、R527、C162、秋B、D62B系列水稻及对照,进行了田间抗三化螟性调查和评价。结果表明:与对照相比,用枯心指数和白穗指数作评价指标,所有转sck水稻在早造和晚造大田种植中对三化螟抗性均明显提高,达中抗以上,而对照均为中感或感级。而且评价指标枯心指数和白穗指数之间,早造和晚造之间所得结果较一致,在以后抗螟虫鉴定中可考虑选用枯心指数或白穗指数作指标,在早造或晚造进行。

转sck基因水稻目的基因表达特异性

对转sck基因水稻T6代生长发育不同时期的不同组织部位sck基因在转录水平和翻译水平的表达特异性进行了研究，结果显示，转基因植株的叶片、茎部、根部sck基因在转录水平和翻译水平均有表达，其中叶片的表达水平明显高于茎部和根部；在成熟的种子中CpTI外源蛋白含量低于检测低限（〈0．014μg／ml），不能被定量。不同生长发育时期叶片的sck基因表达水平在分蘖期、幼穗发育期、开花结实期差别不大，幼苗期的表达水平明显低于其他时期。可见，所转入的外源基因已经能在T6代转基因水稻的不同生长时期的不同组织部位稳定表达，并且在不同时期的根、茎、叶中可以定量检测。

转sck基因水稻中CpTI蛋白的细胞内定位

目的转sck基因水稻中CpTI蛋白细胞内定位。方法运用免疫组织化学方法,应用免疫电镜技术,观察在转sck基因水稻根部细胞、叶片细胞中CpTI蛋白的定位情况。结果在转sck基因水稻根尖部细胞的内质网中和内质网附近有胶体金颗粒大量存在,细胞的质体、叶绿体、细胞质、细胞核中也散在一些胶体金颗粒,在对照水稻的根部内质网和其他部位未发现胶体金颗粒存在。水稻叶片细胞由于有叶泡的存在,内质网不明显,但是细胞核、细胞质和质体内也发现胶体金颗粒,在非转基因水稻的叶片中未发现胶体金颗粒。结论转sck基因水稻中的CpTI蛋白在内质网中大量存在,在细胞的质体、叶绿体、细胞质、细胞核中也存在少量CpTI蛋白。

转Cry1Ac/SCK基因糙米作鲤鱼日粮原料营养学评价

利用转CrylAc／SCK基因糙米制作饲料，以亲本糙米为对照组，进行56d饲喂鲤鱼试验；于饲喂28d和56d后，评价转CrylAc／SCK基因糙米对鲤鱼生长性能和肌肉组成成分的影响。结果表明：转CrylAc／SCK基因糙米与亲本糙米相比，水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、氨基酸、钙和总磷等指标均无显著差异（P〉0．05）；在第一生长阶段（1～28d）和第二生长阶段（．29～56d），转CrylAc／SCK基因糙米组与亲本糙米组相比，鲤鱼的生长性能和肌肉营养成分指标未见显著差异（P〉0．05）。

转SCK基因大米对小型猪生长发育的影响

为观察和比较转SCK基因大米和亲本大米对机体生长发育的影响,从而评价转SCK基因大米的营养价值,选用15头雄性断乳中国实验用小型猪为试验对象,随机分成3组,分别是正常对照组(NG)、亲本大米对照组(CG)、转基因大米组(GG),饲料根据实验目的配制,共饲养62d。观察3组动物体格发育(体重、体长、体高、胸围)和脏器发育(脏器重、大体病理和组织病理)等方面的差异。结果表明,亲本大米对照组和转基因大米组动物的体格发育均优于正常对照组;3组动物脏器发育差异不明显,大体病理和组织病理均未观察到转SCK基因大米具有明显的非期望效应。说明外源性基因的插入未改变大米的营养价值或产生对动物的不良影响,转SCK基因大米和亲本大米在动物喂养方面基本满足“实质等同性”的要求。

转sck和hpt基因对水稻不育系及其组合农艺性状的影响

本研究以通过基因枪转化法获得的保持系D62BS-1、2为供体,不育系D62A为受体进行hpt、sck的杂交转移,获得转sck的不育系,并以转育成的不育系D62AS进行杂交配组,对它们进行了遗传表达、农艺性状、叶绿素含量、净光合速率、干物质生产特性、抗虫性的检测。结果表明:sck和hpt能够保持紧密连锁,杂交转移到杂种F1中,但也有极少数的hpt、sck没有实现转移;D62AS及其所配杂交组合的农艺性状、叶绿素含量、净光合速率、干物质生产特性基本保持不变;外源sck基因在杂种F2代按孟德尔单基因显性3:1的方式分离。钻蛀性螟虫危害的水稻白穗植株PCR均检测出阳性株。

sbk和sck双价抗虫转基因水稻的育成和鉴定

将包含2个抗虫基因sbk[修饰后的Cry1A(c)]和sck(修饰后的CpTI)的质粒载体pCDMARUBA-Hyg转入农杆菌EHA105中,感染南粳45的愈伤组织,得到再生植株。用sbk和sck基因的引物进行PCR分析,从97个再生植株中筛选出42个含有2个抗虫基因而没有潮霉素基因的阳性植株。通过Southern杂交发现,42个阳性植株中具有1～5个外源基因拷贝的分别有23、11、5、2和1个单株。用RT-PCR检测发现,4个单拷贝株衍生的28个T3代植株外源基因能正常表达。人工饲喂二化螟幼虫试验也表明,转基因植株的幼虫死亡率达94%～100%,抗虫能力比对照显著提高。筛选出3个农艺性状优良的株系。

转sck单价基因和cry1Ac/sck双价基因水稻对二化螟的致死效应及中肠组织病理变化观察

室内采用离体叶片法研究了转sck单价基因抗虫水稻86AS1和转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻MSB不同生育期主茎顶叶对二化螟幼虫的杀虫效果.结果发现,不同生育期的MSB对二化螟初孵幼虫表现出了很强的毒杀效果,二化螟幼虫校正死亡率在扬花期前均达到90%以上;扬花期和灌浆期抗虫性有所下降,校正死亡率高于80%;成熟期校正死亡率在60%以上.在整个生育期,二化螟幼虫取食86AS1主茎顶叶的校正死亡率均未超过50%.MSB对二化螟幼虫的毒杀效果明显高于86AS1.采用透射电镜观察二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻和转sck单价基因抗虫水稻主茎顶叶后中肠组织的病理变化.结果发现,两种转基因水稻都能够引起二化螟幼虫中肠组织发生病理变化,但病变程度有明显差异.二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻3d,中肠组织受到严重破坏且病理变化明显;取食转sck单价基因抗虫水稻3d,幼虫中肠组织的病理变化却较缓慢.

国槐离体再生及抗虫基因sck的转导

以国槐叶片作为外植体,筛选出诱导不定芽分化的最佳培养基;利用根癌农杆菌介导法将经过修饰的广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck(Signal-CpTI-KDEL)导入国槐。国槐叶片与农杆菌共培养结束后,转移至筛选培养基MS+BA3 mg·L-1+IAA0·05 mg·L-1+G418 8 mg·L-1+Cef 500 mg·L-1上。不定芽在培养基1/2MS+IBA1·0 mg·L-1+G418 10 mg·L-1+Cef 100 mg·L-1上进一步培养获得完整再生植株。通过PCR和Southern blotting检测证明,修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck已成功导入国槐细胞。

转sck+cry1Ac基因水稻对二化螟及二化螟绒茧蜂存活和生长发育的影响

在实验室研究了转sck+cry1Ac基因水稻(MSB)对二化螟Chilosuppressalis(Walker)生长、存活以及经寄主对二化螟绒茧蜂Apanteleschilonis(Munakata)生物学特性的影响。连续取食转sck+cry1Ac基因水稻的二化螟,体重下降、死亡率上升,从第2天开始,其体重显著低于取食明恢86的对照组;从第6天开始,死亡率极显著高于对照组。二化螟取食MSB36h后移至对照水稻上继续取食3、6、9、12天后,死亡率与对照差异都不显著;但体重均低于对照,其中第3天的体重差异达显著水平。二化螟绒茧蜂分别以取食MSB一定时间的3、4、5龄二化螟幼虫为寄主时,寄生率均低于以对照组,其中对4龄幼虫的寄生率差异显著;结茧率与对照差异均不显著;寄生在取食MSB的5龄二化螟幼虫体内的蜂、蛹期显著长于对照,而所结茧的茧长显著短于对照;但卵-幼虫历期、每茧块茧数、羽化率、雌性率、成蜂寿命和前翅长与对照无显著差异。结果表明转sck+cry1Ac基因水稻不仅对二化螟生长和存活有显著影响,而且可经寄主二化螟影响到二化螟绒茧蜂的一些生物学特性。

转Bt+Sck双价基因棉花的遗传稳定性研究

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性,直接关系到转基因材料的应用前景。本研究以转Bt+Sck双价基因棉花纯合株系312-5T2、332-2T2的T0,T1,T2和T3及T4连续世代为材料,Southern杂交进一步证明外源基因已经整合到棉花的基因组,并稳定地遗传给后代;RT-PCR以及抗虫性测定表明,外源抗虫基因在各个转基因世代稳定的表达,为该材料的育种应用打下了基础。

转基因水稻及其杂交后代对稻纵卷叶螟的田间抗性检测

用剥查法,研究了转cry1Ac+SCK 基因水稻及其杂交后代对稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的大田抗性。结果显示,在自然生产条件下,转cry1Ac+SCK 基因的两个株系MSA 与MSB 对稻纵卷叶螟具有极强的抗性。转cry1Ac+SCK 基因稻的杂交后代21S/MSB 与II-32A/MSB 都获得了高抗稻纵卷叶螟性状。MSA、MSB、21S/MSB 与II-32A/MSB 上的稻纵卷叶螟数量、卷叶率、卷叶株率与带虫株率均极显著低于常规对照稻。

抗虫转基因水稻对非靶标害虫褐飞虱取食与产卵行为影响的评价

比较测定褐飞虱在转cry1Ab基因籼稻(B1、B6)和转SCK基因杂交稻恢复系(MSA)及各自亲本对照上的取食与产卵行为。在自由选择寄主植株条件下,褐飞虱于转cry1Ab基因籼稻和转SCK基因杂交稻恢复系上的着虫比率、产卵选择性和产卵量与各自对照嘉早935和明恢86相比均无显著差异,但取食总痕数除B1外则均显著高于对照。在非自由选择寄主植株条件下,褐飞虱不论于转cry1Ab基因籼稻上还是于转SCK基因杂交稻恢复系上,其取食总痕数均显著多于各自对照,而取食24 h后排泄的蜜露则恰反之。综合可见,3个供试抗虫转基因水稻材料对褐飞虱取食是不利的,而对产卵则无显著的影响。

转Bt+Sck棉花的分子检测及其农艺性状分析

以苏棉16为受体通过花粉管通道法导入Bt+Sck基因获得5个转基因株系(301-5 T2、305-5 T2、312-5 T2、314-4T2和332-2 T2),对这5个转基因株系进行了分子杂交及其农艺性状评价。与受体苏棉16相比较,转基因株系的单株铃数和抗虫性显著提高;叶型变小、叶色加深;株高变化不大;铃重、衣分降低,其中305-5 T2和314-4 T2的衣分显著低于受体苏棉16;转Bt+Sck基因纯系的纤维品质与受体苏棉16无显著性差异;除305-5 T2产量低于受体苏棉16外,其余纯系与受体苏棉16的皮棉产量持平。在相同的遗传背景下,不同的转Bt+Sck基因纯系对棉花农艺性状表现所产生的效应有所不同,为培育新的品种提供了可能。

转基因水稻高世代农艺性状的表现

以转SCK基因和bar基因粳稻恢复系超优1号和转GNA基因和hyg基因粳稻保持系早花二号自交高代(恢复系T5,T6,保持系T4,T5)材料为试材,进行抗性筛选鉴定和农艺性状考察。结果表明:转基因恢复系表现高抗除草剂,对二化螟呈不同程度抗性;保持系表现高抗潮霉素,大部分株系低抗稻飞虱,个别高抗褐飞虱、白背飞虱,田间表现高抗条纹叶枯病;转基因不育系表现高抗潮霉素;外源基因导入粳稻恢复系和保持系并在高代稳定表达。转基因恢复系生育期、株高、穗长、穗颈节等性状有不同程度变异;保持系株高、穗型变异较大。转基因恢复系与转基因不育系配制的多元转基因杂交组合F1表现高抗除草剂和潮霉素,其他农艺性状表现与对照(非转基因组合)基本一致。对转基因水稻的安全释放进行了探讨。

转基因大米与亲本大米猪回肠蛋白质及氨基酸消化率的比较研究

目的:比较表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因大米(转SCK基因大米)和亲本大米蛋白质和氨基酸消化率的差异,并探讨其生物利用率的异同。方法:选用猪为实验动物,通过外科手术法在回肠末端放置T型瘘管,分别喂饲转SCK基因大米和亲本大米,收集动物回肠末端消化产物,分析和计算两种大米蛋白质和氨基酸的消化率。结果:转SCK基因大米与亲本大米中蛋白质的表观和真消化率相似;氨基酸消化率测定结果显示,除亲本大米中赖氨酸的表观消化率与SCK基因大米相比有差异外,其余氨基酸的表观和真消化率均无显著性差异。结论:外源性基因的插入未改变大米中蛋白质和氨基酸的消化率,在蛋白质和氨基酸消化率方面基本满足“实质等同性”的要求。