应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA

成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，用地高辛标记的ＣＲＮＡ探针在胰腺切片上进行原位杂交，以检测胰岛Ｂ细胞胰岛素基因表达产物ｍＲＮＡ，同时并用免疫组织化学法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞，进行比较。胰腺经４％多聚甲醛灌注固定，经Ｂｏｕｉｎ液再固定２０ｈ，常规石蜡包埋和切片。经胰岛素ＣＲＮＡ探针杂交的胰腺切片中胰岛Ｂ细胞的胞质和核仁呈阳性反应，阳性信号为蓝色颗粒。瞩岛其他细胞及胰腺腺泡细胞为阴性。方法对照切片中均无阳性信号出现。经与免疫组织化学染色的相邻切片比较证明，原位杂交显示的阳性细胞与胰岛素免疫反应阳性细胞相一致。本研究所用原位杂交方法简单，结果可靠，重复性好。

地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用

以黄鳝F64基因序列为模板设计引物,扩增用于c RNA探针合成的模板,构建F64/p GM-T重组质粒并线性化,利用RNA聚合酶体外转录合成正、反义c RNA探针,并对其进行地高辛标记,利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。结果显示,正义探针未检测到阳性信号,反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达,于V期性腺开始表达。研究结果表明,体外转录法可以有效合成c RNA探针,制备的c RNA探针可以准确检测F64基因的时空表达。

地高辛精标记cRNA探针原位杂交法检测大鼠胃肠胰系统生长抑素mRNA

目的：建立敏感的非放射性原位杂交技术检测胃肠调节肽基因的表达．方法：用体外转录法制备地高辛精（Ｄｉｇ）标记生长抑素ｃＲＮＡ探针，在４％多聚甲醛固定的胃、十二指肠和胰腺恒冷箱切片标本上进行了原位杂交，结果：杂交阳性部位呈紫蓝色，位于胞浆，背景浅淡，反差强烈．含生长抑素ｍＲＮＡ细胞与以前所报道的生长抑素免疫反应细胞的形态、分布均一致。结论：Ｄｉｇ标记ｃＲＮＡ探针原位杂交法敏感、简便、迅速、可靠，可用于胃肠调节肽基因表达的研究．

甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义

目的探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法和意义。方法取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经HindⅢ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验。结果TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性。核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果一致。结论成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况。

DIG 标记的 cRNA 探针用于原位杂交最佳条件探讨

对地高辛（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的反义ＲＮＡ探针用于原位杂交的技术问题进行研究。结果表明：①杂交标本取材后应在１ｈ内放入固定液，时间过长，杂交信号明显降低；②探针工作浓度以０．４ｍｇ／Ｌ为宜，过高或过低影响杂交背景或阳性率；③防止ＲＮａｓｅ的污染是技术成败的关键之一；④杂交温度和时间以４３℃，１６ｈ为宜；⑤防止脱片是原位杂交的基本技术需要。

Scribble在原肠期鸡胚表达的研究

旨在研究极性脚手架蛋白Scibble(Scrib)在原肠期的表达及意义,明确Scrib在早期鸡胚发育中的作用。以含有全长人Scrib的质粒pEGFP-N2-Scrib作为模板克隆出N端一段770 bp左右的片段,从而构建一个新的质粒pSPT18-Scrib;以pSPT18-Scrib为模板进行体外转录制备cRNA探针;并采用原位杂交的方法用此探针检测鸡原肠胚各个时期Scrib的表达情况。结果显示,Scrib在鸡胚四期开始逐渐在原条顶端及两侧的外胚层表达,并随着发育过程向外胚层两侧蔓延扩散,并且在发展到十期时呈现包括神经管和体节在内的广泛的弥散性表达。Scrib的表达规律提示在胚胎发育早期Scrib对外胚层细胞迁移和分化以及而后的器官发生起到重要的作用,为进一步研究Scrib在鸡胚早期发育中的作用提供参考。

TIMP-1在肝纤维化形成过程中的作用

目的 研究TIMP 1在肝纤维化形成过程中的作用。方法 皮下注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型 ;RT PCR扩增TIMP 1cDNA片段 ,定向克隆到转录载体pSPT18上 ,构建pSPT18/TIMP 1重组质粒 ,转化E .coliJM10 9,进行质粒提取、酶切鉴定、序列分析、体外转录合成探针、原位杂交。结果 成功建立小鼠肝纤维化模型 ;获得的TIMP 1目的基因片段大小为 2 6 2bp ,与预期结果相同 ;经酶切鉴定和序列分析证实成功构建了pSPT18/TIMP 1重组质粒 ;原位杂交结果显示 ,TIMP 1主要在激活的肝星型细胞、内皮细胞、间质细胞以及正常肝细胞中表达 ,且随着肝纤维化的逐步形成 ,TIMP 1的表达逐渐升高。结论 TIMP 1参与肝纤维化的形成过程 。

小鼠Brd2基因探针的制备及其在荧光原位杂交实验中的应用

目的:为观察溴结构域包含蛋白2(bromodomain containing protein 2,Brd2)基因在小鼠中枢神经系统的表达与分布,本研究制备了两条地高辛标记的Brd2 cRNA探针。方法:提取小鼠脑组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增得到两个Brd2的DNA片段,并将它们分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中。利用体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针,最后通过荧光原位杂交实验分析所标记探针的特异性及杂交效果。结果:本实验成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,获得了特异性的地高辛标记的Brd2cRNA探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针得到了较好的杂交信号。结论:本实验制备的地高辛标记的cRNA探针可特异地检测Brd2 mRNA,为进一步观察Brd2 mRNA在中枢神经系统的分布及功能研究提供了工具。

大鼠生后发育过程中胃肠胰生长抑素基因的表达

本实验采用地高辛精标记ｃＲＮＡ探针原位杂交技术和ＡＢＣ免疫组织化学方法，研究了大鼠生后发育过程中胃肠胰组织生长抑素（ＳＳ）基因的表达。结果显示，大鼠生后发育过程中，胃腺ＳＳ杂交阳性细胞及ＳＳ－ＩＲ细胞的密度（细胞数／ｍｍ粘膜肌长）均随天龄增长而增大，至第１５天前后达高峰，随后开始下降，至成年时，与出生时水平接近；十二指肠则在生后初期细胞密度较高，５天以后开始降低，第２０天后降至成年水平。胰腺的ＳＳ杂交阳性细胞及ＳＳ－ＩＲ细胞密度（细胞数／ｍｍ２）变化规律与胃腺相似，随天龄增大，至第１０天前后达高峰，第２０天左右降至成年水平，与出生水平接近。研究结果表明，胃肠胰组织ＳＳ基因表达与胃肠胰的生长发育具有一定的相关性。

FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌组织中的表达

用植物凝集素激活正常人单核细胞 ,诱导 Fas L m RNA表达 ,提取总 RNA,经逆转录多聚酶链反应( RT- PCR)筛选 Fas L基因片段。定向克隆入质粒 p SPT1 9,多克隆位点获取重组质粒 ,经 DNA测序后体外转录制备 Dig- Fas L c RNA探针。收集经病理证实的肺癌及癌周正常肺组织新鲜标本 ,用液氮速冻 ,4%多聚甲醛固定。在冰冻切片上以 c RNA探针原位杂交进行 Fas L m RNA表达分布的观察。结果 :在鳞癌、腺癌和小细胞肺癌的癌组织及癌旁肺组织中均可检出 Fas L的杂交信号。镜下见鳞癌组织中 Fas

皮肤晚期反应标本中IL-6和IL-8 mRNA的表达及意义

为探讨 IL - 6和 IL - 8在皮肤晚期反应 ( L PR)标本中的变化 ,采用原位杂交技术 ,测定了 IL - 6和 IL - 8m RNA在 14例夏季枯草热患者变应原诱导的 L PR标本中的表达。 14例标本中 ,两种细胞因子表达的阳性率分别为 85 .7% ( 12 / 14 )和 92 .8% ( 13 / 14 ) ;与对照标本比较 ,变应原攻击标本中表达上述细胞因子 m RNA的阳性细胞数明显增加 ( P<0 .0 1)。提示 IL- 6和 IL- 8在 L PR的发病中起重要作用。

上皮性卵巢癌组织中DPPⅣ mRNA的表达及意义

目的探讨上皮性卵巢癌组织中二肽基肽酶(DPP)mRNA的表达及临床意义。方法设计5′端含有T7RNA聚合酶启动子序列的PCR引物,以质粒pcD26His的cDNA为模板扩增得到DNA片段,并在T7RNA聚合酶作用下,采用体外转录方法合成FITC标记的DPP RNA探针,对86例卵巢上皮性癌石蜡包埋组织进行原位杂交,检测其DPP mRNA的表达,12例正常卵巢组织作对照。结果86例卵巢癌组织中的DPP mRNA0、1、2、3级表达者分别为2、18、40和26例,阳性表达率为97.67%(84/86),显著高于对照组的16.66%(2/12),P<0.01;其表达与卵巢癌组织学分级和临床分期有关。结论DPP mRNA在卵巢癌组织中的表达增高,在卵巢癌的发生发展中起一定作用。

原位杂交检测鸡肿瘤病

本研究旨在运用原位杂交检测方法检测鸡的肿瘤病。根据GenBank中登录的MDV、ALV-J和REV参考毒株序列,设计并合成3对引物,经PCR方法扩增出相应的片段,并进行了克隆测序。将测序正确的片段亚克隆至pSPT-18,经转录得到DIG标记的特异cRNA探针。将探针分别与3种肿瘤病阳性组织石蜡切片进行杂交,可看到阳性信号,特异性、敏感性较好。运用该方法对32份疑似肿瘤病料进行了检测,MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为25.00%、18.75%和3.13%。结果提示,鸡肿瘤病在鸡场中仍广泛存在。

二肽基肽酶Ⅳ与卵巢上皮性癌临床病理特征和预后的关系

目的探讨卵巢上皮性癌组织中二肽基肽酶Ⅳ（DPPⅣ）的表达及临床意义。方法采用免疫组化法检测378例卵巢上皮性癌组织中DPPⅣ蛋白的表达，采用原位杂交法检测86例卵巢上皮性癌组织中DPPⅣ mRNA的表达，42例正常卵巢组织作为对照。结果DPPⅣ蛋白在卵巢上皮性癌组织中的总阳性表达率为92．9％（351／378），在正常卵巢组织中的总阳性表达率为59．5％（25／42），差异有统计学意义（P=0．001）。DPPⅣ蛋白的表达与患者的发病年龄、肿瘤分化程度和FIGO分期无关（均P〉0．05），而与肿瘤的组织学类型有关（P=0．005）。DPPⅣ蛋白的表达水平越高，患者的生存期越短（P=0．023）。DPPⅣ mRNA在卵巢上皮性癌组织中的总阳性表达率为97．7％（84／86），在正常卵巢组织中的总阳性表达率为64．3％（27／42），差异有统计学意义（P〈0．05）。卵巢上皮性癌组织中DPPⅣ蛋白和mRNA的表达与定位一致，且二者呈正相关（P=0．001）。结论DPPⅣ在卵巢上皮性癌的发生发展中起着一定作用，其表达水平可能成为影响患者预后的因素。

大鼠代谢型谷氨酸受体1亚型基因片段的克隆及其在小脑的表达

目的 克隆大鼠代谢型谷氨酸受体 1亚型 (mGluR1 )基因特异片段 ,制备cRNA探针。方法 从Wistar大鼠小脑中提取总RNA ,以RT PCR方法得到预期的 599bp条带 ,将这一片段克隆到pGEM Teasy载体上 ,经酶切鉴定正确后送测序。将重组质粒经限制性内切酶酶切制备成线性模板 ,通过体外转录的方法合成地高辛标记的mGluR1cRNA正义及反义探针。取成年Wistar大鼠小脑组织进行原位杂交实验 ,以检测探针的可靠性。结果 测序证实用RT PCR的方法获得了mGluR1基因特异片段 ,成功地构建了pGEM TmGluR1重组质粒。根据斑点杂交实验结果计算出正义、反义探针浓度分别为 1 0ng/ μl及 30ng/ μl。原位杂交实验的结果显示 ,用mGluR1反义探针进行杂交的阳性信号主要分布在大鼠小脑蒲肯野氏细胞胞浆 ,用正义探针杂交无阳性信号。结论 本实验克隆了mGluR1基因特异片段 ,并制备了cRNA探针 ,用大鼠小脑进行的原位杂交实验显示 ,此探针灵敏度高 。