拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析

根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点。共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间)。利用MEGA4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6%、17.8%、28.9%和15.7%,G+C的含量平均为33.5%。分析结果表明,在所克隆的761 bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8%。在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8%),12个为A/G转换(占41.4%),2个为A/T颠换(占6.90%),1个为G/C颠换(占3.45%),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换。氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化;其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化。这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记。

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)PP2A调节亚基B的基因克隆与表达分析

采用RT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹PP2A调节亚基B(PP2A-B)的cDNA全序列,全长2040bp,开放阅读框(ORF)为1332bp,可编码443个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与其它一些物种具有很高相似性,推测PP2A-B基因具有很高的保守性。经荧光定量PCR检测,PP2A-B基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑、卵巢、鳃中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,PP2A-B基因在卵巢未发育期(I期)表达量最高,此后各期逐渐下降,推测PP2A-B在卵巢中可能以PP2A全酶的形式存在,抑制卵巢发育。

六个青蟹群体的线粒体16S rRNA和COI基因部分序列差异

对从广东阳江,广东吴川,广东珠海,福建东山,海南海口,海南三亚等六地区采集的六个青蟹群体进行分子遗传差异的研究。针对16S rRNA和COI序列进行群体间比对,聚类分析以及单倍型研究,其中各群体16S rRNA和COI序列相似度分别为99.69%,98.99%,平均遗传距离为0.033和0.018。聚类分析将全部个体的16S rRNA与Scylla paramamosain归为一类,将COI序列全部混杂,无按地理位置聚类现象。单倍型研究共发现33种单倍型,其中三亚群体单倍型分布最散,且在最为集中的A型中无三亚样本。研究结果表明东山等六地青蟹群体分子遗传背景基本相似。

青蟹线粒体COI假基因的分离和特征分析

线粒体DNA标记在遗传结构和系统进化研究中得到广泛应用,然而核假基因的存在对此有很大威胁。本文以中国东南沿海的青蟹(Scylla paramam osain)为研究对象,利用线粒体COI基因的通用引物和特异性引物进行扩增,分别得到34个假基因(nuc learm itochondrial pseudogenes,Num ts)和5个线粒体COI基因序列。在所获得的34个假基因中共定义了29种单倍型,根据序列的相似度,这些假基因可以分为2类,每类假基因都有各自保守的核苷酸序列。第Ⅰ类假基因存在2处插入序列和1处8 bp的缺失序列,这些位点导致了整个阅读框的移位;在第Ⅱ类假基因和5个线粒体COI序列中只有碱基替换,未发现插入和缺失序列。实验结果分析表明,这两类假基因分别代表了2次核整合事件,即核转移事件的最低值。研究结果提示了利用线粒体DNA进行青蟹遗传结构和系统进化研究时应警惕假基因的干扰。

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。

大黄多糖对拟穴青蟹免疫相关基因表达的影响

运用RT-PCR技术探索拟穴青蟹(Scylla paramamosain)注射免疫增强剂——大黄多糖(rhubarb polysaccharide,RP)后11个免疫相关基因的表达变化情况。结果发现,大黄多糖刺激拟穴青蟹4 d后,血细胞中4个基因(丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化氢酶、过氧化物还原酶和酚氧化酶原)表达水平分别上调1.1倍、4.1倍、1.3倍和2.1倍,与对照组相比,存在极显著(P<0.01)或显著性差异(P<0.05)。肝胰腺中5个基因表达变化显著(P<0.05),其中丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化物还原酶和抗脂多糖因子3个基因表达分别上调2.1倍、4.8倍和1.7倍;过氧化氢酶和溶菌酶仅在实验组中表达,未见其在对照组表达。由此推测,丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化氢酶、过氧化物还原酶、酚氧化酶原、抗脂多糖因子和溶菌酶6个基因可能与拟穴青蟹免疫增强有关。

拟穴青蟹3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与表达

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase,GAPDH)是维持生命最基本活动的关键酶之一。采用RT-PCR、RACE等技术,获得了拟穴青蟹gapdh基因全长cDNA序列。该序列全长1 440 bp,开放阅读框(ORF)为1 008 bp,编码335个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与其他一些物种具有很高相似性,推测gapdh基因具有很高的保守性。经荧光定量PCR检测,gapdh基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且在胸神经团、眼柄神经节、卵巢、表皮中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,gapdh基因在卵巢发育早期(Ⅱ期)表达量最高,在卵巢发育成熟期(Ⅴ期)表达量最低,由此推测GAPDH主要参与了卵巢的细胞分裂增殖过程。

拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选

为获得适用于研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同发育时期胚胎基因表达的内参基因,本研究采用3个内参基因筛选软件geNorm、NormFinder及BestKeeper对微管蛋白α1A(Tuba1a)、核糖体蛋白L13(Rpl13)、泛素(UBQ)、核糖体蛋白S6激酶(Rps6)、精氨酸激酶(Ak)、3-磷酸甘油脱氢酶(gapdh)、28S核糖体RNA(28S)、18S核糖体RNA(18S)和延伸因子1A基因(EF-1α)等9个常用候选内参基因在拟穴青蟹不同发育时期胚胎的表达稳定性进行分析。geNorm分析表明, EF-1α和Rpl13的表达稳定性最高,并且采用2个内参基因同时校正目标基因的定量结果可以达到最优效果; NormFinder分析表明, gapdh和EF-1α是9个候选内参基因中表达最稳定的; BestKeeper分析表明,gapdh的标准偏差和变异系数是9个候选基因中最低的。综合3个内参基因筛选软件,可以选用EF-1α,或选用EF-1α和gapdh双内参同时校正拟穴青蟹不同胚胎发育时期各基因的表达情况。

利用PCR-RFLP技术分析拟穴青蟹抗菌肽基因SCY2的SNP位点

本研究根据公布的锯缘青蟹SCY2基因序列设计引物SCY2-RFLPs和SCY2-RFLPa,利用PCR-RFLP技术分析了5个地理群体(宁德、汕头、万宁、东方、三亚)共计148个拟穴青蟹SCY2基因的多态性.结果表明,所扩增的SCY2基因片段含有2个StuⅠ内切酶识别位点,位于第一外显子的位点没有多态性,位于第一内含子的位点存在多态性.在148个个体中共检测到AA和AB两种基因型,等位基因B的出现频率非常低,只在三亚群体的1个个体中检测到,而在其他4个群体中均未检测到,其等位基因频率为0.003 4.序列分析结果表明,扩增片段长度为1 016 bp,包含部分5′非翻译区(282 bp)、第一外显子(131 bp)和部分第一内含子(603 bp).AA基因型表现为3条带(从大到小依次为509,356,151 bp),AB基因型表现为4条带(从大到小依次为660,509,356,151bp).B等位基因是由于867 bp处发生了C→G的单碱基突变导致StuⅠ内切酶失去了1个识别位点而形成的.