泡桐丛枝植原体Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因的克隆及蛋白特性分析

采用PCR方法扩增Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因,并进行了生物信息学分析。通过SWISS-MODEL同源建模与3D-PSSM折叠子识别法构建蛋白质的三维结构,并通过PROCHECK程序验证构建的三维结构的可靠性。首次从泡桐丛枝(PaWB)植原体基因组中分离出Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因,各基因全长依次为2 508、1 242 bp和411 bp,分别编码835、204个及136个氨基酸的蛋白。SecA、SecY和SecE均为脂溶性稳定蛋白,SecA无明显跨膜区,SecY和SecE分别含有10个和3个明显的疏水跨膜区。二级结构主要为螺旋,其次为折叠和无规则卷曲,没有转角。构建的三维结构符合立体化学原则。泡桐丛枝(PaWB)植原体中存在的Sec分泌蛋白转运系统作为最主要的运输途径,可能直接转运菌体蛋白如毒素等直接到寄主细胞质中或介体昆虫细胞中,引起寄主病症。研究植原体的Sec蛋白转运系统对于了解植原体的致病机理及预防这类病害的发生提供了理论依据。

IpaB-IpgC相互作用决定了Ⅲ型分泌系统转运蛋白的结合功能域

毒力因子经Ⅲ型分泌系统转运入宿主细胞是肠道致病菌致病必需的。毒力因子分泌前，分子伴侣与毒力因子在胞质中特异性结合。侵袭质粒基因C（IpgC）是一个伴侣分子，能结合志贺菌的侵袭质粒抗原B（IpaB）和C（IpgC）。该研究报道了IpgC的晶体结构以及与IpaB相结合的晶体结构。

芽孢杆菌subtilis str Sec分泌蛋白预测分析

枯草芽孢杆菌是一类广泛存在植物和土壤中的具有较强抗逆性的革兰氏阳性益生菌,具有繁殖快,能抑制有害菌的生长等特点,是研究菌种的典型菌株。蛋白的Sec分泌途径的分析能够认识该菌株的生理功能和与宿主之间的作用机理。方法：Sec途径分泌蛋白具有I型信号肽的分泌蛋白Spase I和II型信号肽的分泌蛋白Spase II。首先在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中下载枯草芽孢杆菌subtilis str168 Sec途径构件蛋白对应的氨基酸序列,然后用一系列生物信息学软件分析该菌基因组中Sec途径分泌蛋白信号肽、跨膜螺旋数和进行COG功能数据库对各类蛋白进行注释和功能聚分析。结果：结果显示Sec途径Spase I类肽酶识别的蛋白个数为172个,其中具有COG功能的蛋白有141个,Spase II类肽酶识别的蛋白个数为61个。结论：枯草芽孢杆菌外表面的分泌途径系统比较完整,是典型的研究菌株,但是对于Sec分泌途径的报道尚未有。本课题通过对枯草芽孢杆菌subtilis str168 Sec途径分泌蛋白信号肽和功能分析,得知该菌的Sec途径分泌蛋白的蛋白长度、编号、数量和COG功能等,为研究该菌的分泌系统提供了理论依据和基础。

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统结构与功能研究进展

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统(type Ⅸ secretion system,T9SS)是一种最近被发现的新型蛋白分泌系统,它广泛分布于拟杆菌中。T9SS结构复杂、功能强大,目前已经得到验证的T9SS组分20余种,并且仅在牙龈卟啉单胞菌中即能分泌30余种毒力因子,对牙龈卟啉单胞菌的致病性意义重大。T9SS是一个横跨细胞内膜、细胞周质、细胞外膜的大型蛋白复合体,通过各组分之间结构和功能上的联系,组成了一个包括动力提供、能量转导、内外膜易位、外膜修饰及调节系统的精密功能复合体,对货物蛋白进行识别、转运、剪切、修饰,并将细菌胞内货物蛋白转运至细胞表面。近年来,随着X线衍射及原位冷冻电镜技术的发展,对T9SS的探究也从单一组分的功能研究发展至多蛋白复合体原位结构研究,但是目前对蛋白结构解析仍存在分辨率不高、无法捕捉动态功能结构等问题,未来研究方向应该更集中于探索T9SS如何与货物蛋白相互作用并发挥功能。本文对牙龈卟啉单胞菌T9SS在X线衍射及冷冻电镜结构解析上的研究进展做一综述,以便深入理解T9SS的转运机制。

大肠杆菌蛋白质分泌机理及其重组蛋白分泌表达新进展

大肠杆菌是表达重组蛋白运用最广泛的宿主之一。异源蛋白在大肠杆菌中的表达往往会形成不溶性的包涵体;表达蛋白如果分泌至周质甚至胞外,不仅能够正确折叠,而且能简化后续的纯化;信号肽在蛋白分泌的过程中起关键作用,本文综述了大肠杆菌的跨膜转运途径与基本分泌系统,阐述了信号肽的结构与序列对重组蛋白分泌能力的影响,以及提高重组蛋白分泌能力的有效策略,总结了大肠杆菌系统成功实现重组蛋白分泌表达的新进展,为工业酶制剂及蛋白质药物相关技术的发展提供指导。

Ⅴ型分泌系统菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素及其受体结合位点的确定

自主转运蛋白(V型分泌系统)的β结构域已被证明可以将异源性多肽展示在细菌表面。运用DNA重组技术优化构建V型分泌系统MisL并在菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素FedF及其受体结合域FedF1。含重组质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1大肠杆菌(E.coli)DH5α经厌氧诱导后,分别与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子血清和F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪的小肠上皮细胞做玻板凝集试验和体外黏附试验,结果表明上述两株诱导表达重组菌与FedF抗血清发生明显的凝集反应,且能较好地黏附于F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪小肠上皮细胞。而菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素FedF突变体FedF(M)(黏附素受体结合域第88和89位组氨酸残基双突变为丙氨酸)的重组菌则失去上述凝集和黏附特性。以上试验结果说明,F18大肠杆菌黏附素FedF及其受体结合域FedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,并进一步证明了位于FedF受体结合域内第88和89位组氨酸残基对FedF受体结合域的形成至关重要。

细菌Ⅴ型分泌系统研究进展

目前已知革兰阴性(G-)细菌的分泌系统至少有5种类型,即Ⅰ～Ⅴ型。其中Ⅴ型分泌系统为G-菌外膜通道转运蛋白系统中最大的一个家族,该系统又称自主转运蛋白系统,它首先通过Sec依赖的分泌通路跨内膜转运,到达外周质间隙后,又通过自身的C端在外膜上形成一个β折叠桶实现跨外膜转运。Ⅴ型分泌系统的分泌装置最为单一,且该系统分泌的蛋白在跨外膜转运过程中似乎不需要能量和辅助因子(蛋白)的参与。随着对运用Ⅴ型分泌系统在G-菌表面展示异源性多肽/蛋白质的深入研究,该系统在生物技术领域已展示出巨大的应用前景。

细菌Ⅵ型分泌系统的研究进展

细菌的分泌系统（secretionsystem）像注射器一样将细菌合成的毒性蛋白转运到外界环境或是宿主细胞内，与细菌的致病性密切相关。目前已经发现了6种细菌分泌系统，按其分泌是否利用Sec转位酶可分为两大类：一类是利用Sec转位酶（translocase）和N末端信号序列进行蛋白转运的，包括Ⅱ型（T2SS）和V型分泌系统（TSSS）；另一类则不依赖Sec转位酶，如I型（T1SS）、Ⅲ型（T3SS）、Ⅳ型（T4SS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS）。

细菌Ⅶ型分泌系统的研究进展

蛋白分泌在调控细菌与周围环境的互相作用中起着重要的作用。革兰氏阴性菌的分泌涉及内膜和外膜的跨膜转运,已知的6种蛋白分泌系统均显示出相当可观的多样性。而革兰氏阳性菌除了部分蛋白通过其中的几种分泌系统来分泌外,其还进化、发展出了一种特殊的蛋白分泌系统,就是Ⅶ型分泌系统（TypeⅦSecretion System,

葡萄糖转运蛋白2与胰岛β细胞研究进展

葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）在胰岛β细胞、肝、肠、肾以及中枢神经系统中均有表达。对基因修饰小鼠的生理学研究揭示了GLUT-2在不同的调控机制中通过影响胰岛β细胞发挥调节葡萄糖代谢的作用。在胰岛β细胞中,GLUT-2是葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）所必需的。在肝细胞中,观察到GLUT-2表达受到抑制,表明在肝细胞中存在另一种葡萄糖输出途径.

细菌Ⅷ型分泌系统的研究进展

细菌为了促进生物被膜(Biofilm,BF)的形成、提高对宿主细胞的黏附和定植能力,进化出了许多简洁的机制,用来加工、组装和分泌相应的功能性蛋白[1]。目前已经在细菌中发现了9种分泌系统,包括:Ⅰ型分泌系统(Type Ⅰ secretion system,TISS)由3种蛋白(内膜ABC转运蛋白、周质膜融合蛋白和外膜孔蛋白)组成跨细胞双层膜的复合物,使分泌的蛋白一次性穿过内外膜分泌到胞外[2];Ⅱ型分泌系统(T2SS),与V型分泌系统(T5SS)的蛋白均依赖内膜上的Sec转位酶进入细胞周质,再利用β折叠桶实现跨外膜分泌[3];Ⅲ型分泌系统(T3SS)较复杂,效应蛋白利用针状复合体以注射的方式注入宿主细胞内[4]。

细菌三型分泌系统效应蛋白转运的研究进展

三型分泌系统(Type 3 secretion system,T3SS)作为存在于革兰氏阴性菌中的分泌系统之一,对革兰氏阴性菌的致病有重要作用。T3SS的致病作用体现在T3SS能直接将效应蛋白转运至宿主细胞,进而通过效应蛋白调控细胞的一系列通路,促进细菌定殖于细胞。而效应蛋白的转运受到两方面因素的调控,一方面是效应蛋白本身的信号序列,另一方面是T3SS相关蛋白的辅助。本文围绕近年来T3SS的构成、效应蛋白转运机制方面的最新进展进行概要综述。

双精氨酸转运(Tat)系统及其在大肠杆菌分泌表达重组蛋白中的应用

常见的分泌途径(Sec途径)是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径,而双精氨酸转运(Tat)则是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统,该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序。与Sec途径相比,Tat系统的显著优点是它只分泌已正确折叠的蛋白,而未正确折叠的蛋白则不能通过该系统分泌,这样就保证了分泌产物在结构上的正确性。因此,研究利用Tat信号肽牵引重组蛋白通过Tat系统进行分泌跨膜转运在重组蛋白的表达方面具有很好的应用前景。

鸡水通道蛋白研究进展

水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是细胞膜上能高效选择性地转运水分子的特异性孔道。迄今为止已经发现了13个不同类型的水通道蛋白(AQP0-AQP12),在结构上,AQPs是整合膜水转运蛋白小分子混合物(~30 kDa)。组织定位和调节研究表明,AQPs在生理上涉及液体分泌和吸收的细胞中表达,例如在眼睛,中枢神经系统,外分泌腺,肾脏和脂肪组织中。

革兰氏阴性菌Ⅵ型分泌系统及其参与金属离子转运的研究进展

细菌通过其分泌系统将特定的效应蛋白输送到外界环境或进入靶细胞中,从而在细菌和宿主、细菌和微生物群落的相互作用中占据适应性优势。Ⅵ型分泌系统(The type VI secretion system,T6SS)是革兰氏阴性菌中广泛存在的大分子分泌装置,其结构和功能类似于可收缩的噬菌体尾针样,通过细胞间直接接触将细菌各种酶或毒素效应蛋白转运到原核和真核生物中,从而介导细菌间竞争以及对宿主的致病过程。有些效应蛋白还可通过非接触依赖的方式进入胞外环境来帮助细菌获取稀缺金属离子,并且它们对应激条件下细胞内金属稳态的维持至关重要。这篇综述总结了Ⅵ型分泌系统的结构、组装及其分泌的效应蛋白,并重点阐述了Ⅵ型分泌系统在多种金属离子转运机制中作用的研究进展,有助于理解T6SS在细菌间相互作用和细菌感染过程中发挥的重要作用。

梨火疫菌Sec依赖分泌蛋白酶的全基因组鉴定及其在侵染幼梨过程中的基因表达分析

目的:鉴定参与梨火疫菌侵染的重要Sec依赖分泌蛋白酶。创新点:构建了梨火疫菌Sec依赖分泌蛋白酶编码基因在侵染寄主植物过程中的时序表达图谱。方法:利用生物信息学与大肠杆菌Pho A检测体系两者结合,在全基因组水平筛选并鉴定梨火疫菌的Sec依赖分泌蛋白酶;利用逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR),分析Sec依赖分泌蛋白酶编码基因在梨火疫菌侵染寄主植物过程中转录表达的时序变化。结论:梨火疫菌含有完整的Sec分泌系统,可由此分泌至少15种蛋白酶,其中11种蛋白酶可能在病原菌侵染寄主植物过程中发挥功能。

高等植物重金属耐性与超积累特性及其分子机理研究

由于重金属污染日益严重,重金属在土壤_植物系统中的行为引起了人们的高度重视。高等植物对重金属的耐性与积累性,已经成为污染生态学研究的热点。近年来,由于分子生态学等学科的发展,有关植物对重金属的解毒和耐性机理、重金属离子富集机制的研究取得了较大进展。高等植物对重金属的耐性和积累在种间和基因型之间存在很大差异。根系是重金属等土壤污染物进入植物的门户。根系分泌物改变重金属的生物有效性和毒性,并在植物吸收重金属的过程中发挥重要作用。土壤中的大部分重金属离子都是通过金属转运蛋白进入根细胞,并在植物体内进一步转运至液泡贮存。在重金属胁迫条件下植物螯合肽(PC)的合成是植物对胁迫的一种适应性反应。耐性基因型合成较多的PC ,谷胱甘肽(GSH)是合成PC的前体,重金属与PC螯合并转移至液泡中贮存,从而达到解毒效果。金属硫蛋白(MTs)与PC一样,可以与重金属离子螯合,从而降低重金属离子的毒性。该文从分子水平上论述了根系分泌物、金属转运蛋白、MTs、PC、GSH在重金属耐性及超积累性中的作用,评述了近10年来这方面的研究进展,并在此基础上提出存在的问题和今后研究的重点。

F18大肠杆菌黏附素受体结合域鉴定新方法

运用DNA重组技术将F18ab和F18ac大肠杆菌黏附素fedF亚单位内的第60～109位氨基酸残基区段(fedF1)和fedF全基因克隆入V型分泌系统MisL的载客结构域上,经DNA测序确证其正确阅读框后,含重组菌质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1经厌氧诱导后,与断奶仔猪小肠上皮细胞进行体外黏附试验。结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述重组菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。上述重组菌均能与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子高免血清发生玻板凝集反应。而FedF突变体FedF(M)的重组质粒菌则失去上述凝集和黏附特性。证明F18大肠杆菌黏附素fedF基因及其基因片段fedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,F18ab和F18ac黏附素FedF直接介导F18大肠杆菌与易感仔猪小肠上皮细胞表面大分子受体黏附结合,fedF1为黏附素FedF的受体主要结合域,其His88、His99是FedF黏附素受体结合域的重要氨基酸残基。